感染病的病原學檢查
感染病的病原學檢查主要包括塗片鏡檢、培養、鑒定和藥物敏感試驗。
1）塗片、染色和鏡檢
（1）塗片
對臨床微生物標本採用塗片後直接形態學檢查，是診斷很多感染性疾病病原的最基本和快速的方法。標本塗片分直接塗片、漂浮集菌、離心沉澱和KOH處理塗片法。
一般菌常使用直接塗片，即將標本直接均勻塗抹在玻片上，塗膜厚度以清楚顯現報紙上的字為準。
抗酸桿菌塗片分為直接塗片、漂浮集菌、離心沉澱三種塗片法，陽性檢出率以離心沉澱法最高，漂浮集菌法次之，直接塗片法最低；離心沉澱分直接離心沉澱和消化後離心沉澱，直接離心沉澱常見於無菌體液，消化後離心沉澱常用於呼吸道標本；消化離心沉澱分為溶痰劑處理及氫氧化鈉處理兩種，對於呼吸道標本，建議溶痰劑處理後離心，取沉澱物塗片，其陽性率高於氫氧化鈉處理；氫氧化鈉消化常用於呼吸道標本、蛋白含量高的無菌體液，與無菌體液直接離心沉澱相比，可避免染色時塗膜脫落現象，提高無菌體液鏡檢陽性率。
真菌塗片分直接塗片和KOH處理後塗片，後者陽性率高於前者。
（2）染色
染色方法分革蘭染色、墨汁負染、六胺銀染色、瑞氏染色或瑞吉染色、抗酸染色、金胺O熒光染色、鈣熒光白染色等。
革蘭染色常用於一般菌和酵母菌染色，優點是操作簡便、易於掌握，但陽性率低。
墨汁染色常用於體液、灌洗液及支刷物中隱球菌的檢測，特點是操作簡便、費時短，2分鐘左右即可完成。
六胺銀染色常用於肺孢子菌的染色，該方法操作繁瑣，與瑞吉染色相比，肺孢子菌形態易於辨認，也可適用於其它真菌的染色鏡檢。
瑞氏染色或瑞吉染色常用於血液或骨髓標本中組織胞漿菌或馬爾尼菲藍狀菌的染色鏡檢，也可適用於血培養陽性標本的塗片染色鏡檢，防止短小革蘭陰性菌的漏檢，如嗜血桿菌屬。
抗酸染色和金胺O熒光染色適用於抗酸桿菌染色，後者陽性率高於前者10%左右。
鈣熒光白染色適用於臨床標本中真菌的染色鏡檢，其陽性檢出率高於真菌直接塗片和10%～20%KOH處理法。
2）微生物的分離培養、鑒定
（1）病原菌的培養檢出是對感染性疾病的確證，根據臨床要求，送驗標本的性質和培養的目的，選用適合不同細菌生長的培養基和培養條件。培養條件分為需氧培養、厭氧培養、二氧化碳培養。需氧培養為實驗室常用的方法，將接種的培養基放置25℃-35℃溫箱,24～72h，適用於一般需氧菌、兼性厭氧菌和真菌的培養。厭氧培養常用的方法有厭氧罐法、氣袋法及厭氧箱法三種。二氧化碳培養有些苛氧菌在初次分離培養時，需置於5%～10%的CO2環境中才能生長良好，常用的方法為二氧化碳培養箱和燭缸法。除一般細菌、真菌外，可以體外人工培養的還有支原體、病毒、立克次體和衣原體等。
（2） 細菌與酵母菌的生化鑒定是根據不同病原菌對碳水化合物的發酵反應、不同酶系統和代謝產物或菌液生長濁度等指標，選擇一組生化反應系統鑒定細菌和酵母菌。將待檢微生物的純培養經稀釋後接種於含各種生化試劑、指示劑和培養基的塑料板小孔中，培養 4～24 小時後觀察結果。國外已商品化的有 API 系列、ATB系列、VITEK2系列、MicroScan、Phoenix和SensititreARIS等。本法優點是生化反應指標多，操作簡便，結果可靠，重複性好、鑒定正確性為70～90%。 絲狀真菌鑒定為通過觀察菌落特點和鏡下特徵結構，對其進行鑒定到種或屬。 寄生蟲鑒定主要通過鏡檢特徵進行直接鑒定。
3）藥物敏感性試驗
測定抗菌藥物在體外對病原微生物有無抑制作用的方法稱為藥物敏感性試驗。各種致病菌對不同抗菌藥物的敏感性不同，同一種細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性亦有差異；因此葯敏測定結果的正確與否與臨床療效的關係極為密切。可以幫助臨床選擇合適治療的抗菌藥物，特別是複雜的感染治療時，能幫助臨床進行個體化給葯。此外，藥物敏感性試驗還可進行細菌耐藥性監測，了解本醫院、本地區以至全國某種致病菌的耐藥性變遷情況，以便採取有效的措施，防止細菌耐藥性的發生和發展；並可為抗菌藥物的管理和國家制訂新葯的開發研究計劃提供重要的實驗室依據。目前臨床微生物實驗室常用MIC50和MIC90、MBC50和MBC90、抑菌率或敏感率以及抗菌藥物後效應（PAE）等指標對一個新抗菌藥物的體外藥效進行評價。目前我國葯敏試驗是參照美國NCCLS/ CLSI每年發布的標準執行。
（1）常用術語介紹
敏感：用常規用量治療有效，常規用藥時到達的平均血葯濃度超過細菌的MIC5倍以上。
耐葯：用常規用量治療不能抑制細菌的生長。MIC高於藥物在血、體液中可能到達的濃度。
中介：被檢菌MIC接近血、體液中藥物濃度，治療效果不肯定。
劑量依耐性敏感SDD：依賴於患者所用劑量的菌株敏感性，患者應使用最大的允許劑量。（如更高劑量或更頻繁給葯）。
最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC）：即抑制細菌生長所需藥物的最低濃度。試驗時用肉眼觀察，未見細菌生長的最低藥物濃度即為MIC。通常以MIC50和MIC90來表示，即實驗中某種抗菌藥物抑制50％和 90％受試菌生長所需的MIC。
最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration,MBC) ：抗菌藥物試驗使最初的活菌總數減少 99.9％或以上所需要的最低抗菌藥物濃度。通常用MBC50和MBC90來表示，即能將 50％或 90％受試菌的最初活菌總數殺滅 99.9％或以上所需要的抗菌藥物濃度。
多重耐葯（MDRO）：是指有多重耐藥性的病原菌。Multiresistance可以翻譯成多葯耐藥性、多重耐藥性、其定義為一種微生物對三類（比如氨基糖苷類、紅霉素、β－內醯胺類）或三類以上抗生素同時耐葯，而不是同一類三種。
泛耐葯（XDR）：廣泛耐葯細菌指細菌對常用抗菌藥物幾乎全部耐葯，革蘭氏陰性桿菌僅對黏菌素和替加環素敏感，革蘭氏陽性球菌僅對糖肽類和利奈唑胺敏感。
全耐葯（PDR）：泛耐葯細菌指對所有分類的常用抗菌藥物全部耐葯，革蘭氏陰性桿菌對包括黏菌素和替加環素在內的全部抗菌藥物耐葯，革蘭氏陽性球菌對包括糖肽類和利奈唑胺在內的全部抗菌藥物耐葯。
（2） 常用的葯敏測定方法
稀釋法 以一定濃度的抗菌藥物與含有被試菌株的培養基進行一系列不同倍數稀釋（通常為2倍稀釋），經培養後觀察其最低抑菌濃度。稀釋法的最大優點是可以精確測得藥物最低抑菌濃度，但需耗費較多材料、人力和時間。在肉湯稀釋法測定藥物對細菌生長的 MIC 時，可將肉眼無細菌生長的各管每管中取 10uL 分別移種至不含抗菌藥物的瓊脂平皿上；過夜培養後，每塊平板上菌落計數不超過 5 個的相應肉湯管中的最低藥物濃度，即是藥物的最低殺菌濃度（MBC）。微量稀釋法的優點為試劑材料較節省，而且微量板中可預先配製好抗菌藥物和培養基，冷藏後一定時期內使用，較為方便。瓊脂稀釋法配合多點接種器使用，可同時進行大量菌株的葯敏測定，實驗結果重複性好，適宜於工作量大的實驗室採用。缺點是不能進行最低殺菌濃度的測定。
K-B擴散法（紙片法） 根據抑菌圈直徑大小與最低抑菌濃度的相關性，結合臨床上已知敏感或耐葯菌株的狀態進行判定。主要適用於生長較快的需氧菌和兼性厭氧菌的葯敏測定，但不適用於某些專性厭氧菌及酵母樣菌等特殊菌種。紙片法操作簡單，所費材料、人力和時間都較少，重複性好，是目前臨床上最廣泛使用的葯敏測定方法。
E測定法(Epsilometer test. E test) 在瓊脂擴散法的基礎上改良而成。方法是將抗菌藥物放置於 5mm×50mm的不透明薄型塑料帶上，藥物濃度按log2 梯度遞減，共含 15 個不同稀釋度的抗菌葯。塑料帶的反面是相應的藥物濃度標記。將含葯塑料帶代替抗生素紙片進行葯敏試驗，操作步驟與瓊脂擴散法相同。每個直徑 9cm的瓊脂平皿內可放含葯塑料帶 1～2 條，直徑為 14～15cm的平皿可放 4～6 條。過夜培養後在塑料帶周圍形成一橢圓形抑菌圈，其邊緣與塑料帶交叉處的藥物濃度標記即該葯對該細菌的最低抑菌濃度（MIC）。本法與瓊脂稀釋法、微量稀釋法和瓊脂擴散法等測定結果的符合率均在 95％以上。本法可用於營養要求較高、生長緩慢或需特殊培養條件的病原菌的葯敏檢測，如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、淋病奈瑟球菌等，但價格較昂貴為其缺點。
自動化葯敏測定儀 70 年代以後國外相繼開發並上市的自動化葯敏測定儀有 API 、ATB、VITEK2、MicroScan、Phoenix和SensititreARIS等。基本原理是利用光學測量法測定抗菌藥物對細菌的作用，即透光量與菌液濁度成反比。這些自動化儀器測試的優點是：快速，尤其適用於快速生長的細菌和酵母菌，葯敏試驗重複性好，節省人力；但儀器和檢測所用試劑盒或試劑卡價格昂貴，對於生長緩慢或需特殊培養條件的病原菌使用仍有一定限制，測定結果為半定量者，不夠精確，葯敏判斷標準落後，需要經常更新。ATB儀器法對於念珠菌屬，不能準確的識別拖尾，如果儀器判定耐葯的，一定要人工進行確認。
此外，結核分枝桿菌藥物敏感試驗常用的方法包括絕對濃度法和比例法，試驗操作比較繁瑣；結果受多因素影響，可重複性較差；實驗室耐葯與臨床耐葯之間有一定差異。
（3）葯敏結果解讀
不是所有藥物都需要做葯敏試驗，葯敏試驗僅限於體外穩定、有判斷標準的藥物。
某些細菌對某類抗生素天然耐葯，則不需要做葯敏試驗。
檢測耐葯機制，根據耐葯機制推測對其他抗菌藥物的敏感性。
對臨床少見菌及苛養菌引起的感染無需做葯敏試驗，臨床通常經驗性用藥，僅當臨床需要或重症感染時，或葯敏結果對治療很重要時才做葯敏試驗。
體外葯敏試驗只能預測體內治療效果，並不等同， 一般來說，耐葯＝治療無效， 敏感≠治療有效。原因有可能沒有培養出真正的致病菌、同一菌株可能在治療過程中很快出現耐葯、感染部位與葯代學、葯動學因素、藥物劑型及生物利用度原因。
試驗的藥物代表一類葯，而不是一種葯，檢測標誌性藥物，提示對其他抗菌藥物的敏感性，如腸桿菌科，氨苄西林的測試結果可用於預測阿莫西林，對四環素中介或者耐葯的某些菌株可以對多西環素或米諾環素或者二者均敏感；對於葡萄球菌屬，對青黴素敏感的葡萄球菌對其它β內醯胺類敏感，對青黴素耐葯的葡萄球菌對不耐酶青黴素類耐葯，苯唑西林（或者頭孢西丁）敏感葡萄球菌對β內醯胺類/β內醯胺酶抑製劑複合物敏感。
結核分枝桿菌葯敏試驗結果前後不一致的原因分析有：細菌接種量的影響，存在MIC在耐葯臨界點的細菌，WHO已明確指出乙胺丁醇、吡嗪醯胺、鏈黴素、第四組藥物和第五組藥物可靠性和可重複性差，根據這些藥物的葯敏測試結果指導治療時需要特別注意綜合分析，治療過程中發生新的耐葯，患者同時感染敏感菌和耐葯菌，合併肺外結核，肺外器官達不到足夠的藥物濃度，影響療效。
4）血流感染的病原學檢查
血培養是臨床診斷血流感染的金標準，向來被臨床和微生物學實驗室所重視。
正確的微生物學檢驗始自正確的標本採取。
（1）採集血培養時機
血培養應該盡量在使用抗菌葯之前進行；如果已經使用抗菌藥物，盡量在下一次用藥前採集；入院前2周內接受抗菌藥物治療的患者，可選用能中和或吸附抗菌藥物的培養基；可疑細菌性心內膜炎，在1～2h內採集3套血標本，如果24h後陰性，再採集3套以上的血標本。
（2）采血部位
從兩側上肢靜脈采血，「雙瓶雙側」采血培養，至少做到「雙側雙瓶」。必要時從下肢靜脈采血做第三套血培養。不建議採集靜脈留置導管，因其常伴有高污染率。如果必須從留置導管內采血，也應同時從外周靜脈採集另外一個血培養標本，以幫助陽性結果的判讀。
（3）采血量
成人采量是8～10ml/瓶，兒童采量是1～5ml/瓶，血液和肉湯之比為1:5～1:10 。采血量每增加1ml，成年人菌血症陽性檢出率增加3%。當采血量過多時可能導致假陽性，因此應合理控制采血量。
（4）培養瓶接種程序
當被用來做培養的采血量充足時，首先接種厭氧瓶，再注需氧瓶。少於推薦值時，首先接種需氧瓶，然後將剩餘的血液接種入厭氧瓶。
（5）標本運送
血標本接種到培養瓶後，輕輕顛倒混勻以防血液凝固，立即送檢。如果血培養瓶不能及時送檢上機，建議常溫避光保存，室溫放置不要超過2 小時，不可放冰箱保存。
（6）血培養常見病原菌
主要有金黃色葡萄球菌、鏈球菌（A、B群，肺炎鏈球菌）、腸球菌、產單核李斯特菌、腦膜炎奈瑟菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、厭氧菌及深部真菌等。
（7）污染
血液標本在採集轉種過程中均有被污染可能，尤其在靜脈穿刺前，皮膚需嚴格消毒。血培養污染率通常
5）尿路感染的病原學檢查
尿標本採集
（1）中段尿採集法
女性：成年女性外陰部先以皂液清洗，再以無菌水清洗，以無菌紗布或紙擦拭，以中、食指將陰唇分開排尿，棄去前段尿，留取中段尿5～7ml於無菌容器內。
男性：翻轉包皮，用皂液清洗尿道口，用無菌水沖洗，留取中段尿。
（2）導尿或膀胱穿刺採集法：導尿與膀胱穿刺必須在嚴格無菌操作下進行，而且是在必要的情況下才選用，如兒童、不能自動排尿者或者要檢測厭氧菌時才用膀胱穿刺法。
（3）由於尿液是細菌生長的營養基質，採集的尿液應立即送檢，須1h內接種，不能及時接種時應4℃保存，超過6小時。
臨床意義
尿培養對於尿路感染中病原學診斷和治療後療效隨訪均有重要價值。正常人體內，膀胱中的尿液是無菌的，經尿道排出時，受到尿道中細菌的污染，取經尿道排出的中段尿培養，細菌數不會超過103 CFU/ml。患有泌尿系統感染時，尿中的細菌數 >104-5 CFU/ml，以此界限作為診斷泌尿系統感染的依據。對有癥狀的病人在抗菌治療前宜送一次尿培養標本。感染病人的排尿速度太快、接受藥物治療、尿的pH小於5，比重小於1.003時，細菌數目將可能降低。當病人不能排尿或診斷治療必需時採用導尿，但導尿本身也有引起感染的危險。對有留置導尿管病人，可消毒導管後抽取尿液送驗。由於尿液本身是個良好的培養基，細菌可以迅速繁殖，一般應在 1 小時內接種，如超過 1 小時需置冰箱內保存。若同份標本中檢到3種或3種以上細菌，應認為採集或處理標本不當。恥骨上膀胱穿刺菌落數為任意數目，所有細菌都有意義需鑒定和葯敏。
6）胃腸道感染的病原學檢查
糞便標本主要用以檢測沙門菌、志賀菌、彎麴菌、耶爾森菌等菌屬。採集應注意挑取膿血、粘液部分送細菌培養，送檢彎麴菌屬的糞便標本可冰箱冷藏，一次培養陰性不能確定無病原菌，至少三次陰性才能排除。一次糞便鏡檢不能排除腸道寄生蟲，如藍氏鞭毛蟲常間歇出現在標本中。糞便標本中常見的病原菌見表1-1-5-4-1。
表1-1-5-4-1 糞便標本中常見的病原菌
7）呼吸道感染的病原學檢查
正常人體的下呼吸道是無菌的，上呼吸道有正常菌群棲居。呼吸道感染因咳出的痰常受口咽部菌群的污染，故採樣前應先用無菌生理鹽水漱口，然後取深咳出的痰液作為標本。對乾咳、痰少病人用霧化吸入45℃、10％氯化鈉溶液，使痰濕化易於咳出。一份合格的痰標本應該是痰塗片鏡檢每低倍視野＜10 個鱗狀上皮細胞，＞25 個多核白細胞。此外也可通過支氣管鏡採集支氣管肺泡灌洗液、洗刷液或活檢組織，採用遠端封閉長套管可避免口咽部菌群的污染。判斷下呼吸道分泌物中是否有病原菌存在，須對上呼吸道的正常菌群有所了解，上呼吸道的正常菌群有：草綠色鏈球菌、微球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、奈瑟菌（致病菌除外）、嗜血桿菌（流感嗜血桿菌除外）。
8）中樞神經系統感染的病原學檢查
腦脊液標本的微生物檢查具有重要臨床意義。中樞神經系統感染主要為細菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎和腦炎、真菌性腦膜炎、結核性腦膜炎等。腦脊液一般需採集 1～2mL，並儘快送實驗室。流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌都十分脆弱，在採集標本時應盡一切可能立即檢查，如有可能宜在床邊接種以提高培養的陽性率。送達的標本應離心後塗片，做革蘭染色和抗酸染色等。結核性腦膜炎，塗片陽性率為20～30%。懷疑病毒性腦膜炎或腦炎時，取急性期和恢復期血清，作相應的血清學檢查。兒童細菌性腦膜炎最常見的病原菌是腦膜炎奈瑟菌，新生兒以B組鏈球菌為主，其次是產單核李斯特菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌，成人以肺炎鏈球菌為主。外傷後或顱腦術後主要病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單孢菌及鮑曼不動桿菌。隱球菌、麴黴、毛霉、根霉是免疫受抑制患者中樞神經系統感染最常見的病原菌。
作者：錢雪琴
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