NK細胞如何感知腫瘤？PDGF-DD竟是「雙面間諜」

彙報人：LuYin Lab研究生一年級鄒偉

研究背景

血小板衍生因子（platelet-derived growth factor，PDGF）是一種鹼性蛋白，1974年被發現，因其來源於血小板而得名。組織受傷時，巨噬細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞、內皮細胞、胚胎幹細胞等都可以合成並釋放PDGF。PDGF是由兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的同型或異型二聚體，包含五種二聚體結構：PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DD。研究發現[1]許多腫瘤都可以產生PDGF-DD，並且通過自分泌或者旁分泌PDGFR-β信號通路促進細胞增殖、上皮-間質轉化、基質反應以及血管生成，從而支持腫瘤生長。

圖1 血小板衍生因子、血小板衍生因子受體家族及其功能

自然殺傷（Natural Killer，NK）細胞是一種重要的人體免疫細胞，具有識別並裂解腫瘤細胞和病毒感染細胞，產生免疫調節性細胞因子這兩大主要功能。NK細胞缺少基因重排過程，不像T細胞通過特異性TCR識別靶細胞，從而通過胚系基因表達的受體識別靶細胞[2]。

圖2 自然細胞毒性受體（NCR）：NKp30、NKp44、NKp46

來自美國華盛頓大學醫學院的病理學教授Marco Colonna及其研究團隊發現，PDGF-DD能夠被NK細胞表面受體NKp44所識別，兩者有效結合可進一步刺激NK細胞分泌IFN-γ以及TNF-α等細胞因子，從而控制腫瘤生長。

Result 1

確認PDGF-DD是NKp44的配體

NKp44的配體至今尚未完全為人所知，為了解決這個問題，研究人員從含有4000多種提純的人類和鼠類分泌蛋白或單通道跨膜蛋白的胞外域分泌蛋白組庫中篩選出30種NKp44可能的配體，其中就包括PDGF-D，對篩選出的30種蛋白進行重新驗證，確認PDGF-D是NKp44的配體（圖3-A,B）。PDGF-DD通過自分泌或旁分泌PDGFR-β激活信號通路，而PDGF-D與PDGF-DD主要區別在於PDGF-D含有CUB結構域，這個結構域必須經過CUB結構域胞外蛋白水解才可釋放PDGF-DD（圖3-C）。通過固定相結合測定，NKp44可以與PDGF-DD有效結合，並呈現濃度依賴性（圖3-D,E）。此外，PDGF-DD對NKp44的IgSF結構域具有3.3±0.4mM的親和力，且NKp44不結合 CUB-PDGF-D（圖3-F,G）。

圖3 PDGF-DD是NKp44的配體

Result 2

PDGF-DD與NKp44相互作用刺激NK細胞分泌細胞因子

既然PDGF-DD是NKp44的配體，那麼PDGF-DD能否激發NK細胞中ITAM（免疫受體酪氨酸激活基序）信號呢？當NK細胞表面活化的受體與其配體相結合，ITAM被激活引起胞漿內鈣離子內流，而這種現象可以被α-NKp44所阻斷，同時ITAM激活可以誘導AKT，ERK及其下游FOXO3A的磷酸化（圖4-A,B）。接下來，研究人員想要確定的是PDGF-DD與NKp44相互作用對NK細胞功能的影響。使用IL-2激活NK細胞表面受體NKp44，在PDGF-DD的作用下可促進IFN-γ以及TNF-α的分泌（圖4-C,D）。同樣，來自正常供體的NK細胞在PDGF-DD的作用下可分泌IFN-γ、TNF-α，加入α-NKp44時分泌受到抑制。DAP12是一種跨膜受體，在傳遞活性信號中發揮重要作用，若NK細胞DAP12缺失，即使利用PDGF-DD進行刺激，也無法分泌這兩種細胞因子（圖4-E～G）。此外，RNA-seq進一步表明NKp44 / DAP12受體複合物與PDGF-DD結合誘導NK細胞活化，其主要特徵表現為促炎細胞因子和趨化因子的分泌（圖4-H）。

圖4 PDGF-DD與NKp44相互作用促進NK細胞分泌細胞因子

Result 3

PDGF-DD激活ILC3、ILC1分泌細胞因子

NKp44最初被揭示是由於其在黏膜組織中的特異表達，其與癌症免疫監視也密切相關，因而研究人員試圖確定PDGF-DD是否能夠激活固有淋巴細胞ILC3、ILC1？IL-23、PDGF-DD均可以誘導從扁桃體中分離出的ILC3分泌TNF-α，但二者同時刺激ILC3幾乎不會增加TNF-α的分泌（圖5-A,B）。並且ILC3分泌IFN-γ、TNF-α依賴於PDGF-DD與其表面受體NKp44的相互作用（圖5-C,D）。RNA-seq結果進一步表明PDGF-DD在ILC3、ILC1中誘導NKp44依賴的促炎基因程序（圖5-E,F）。

圖5 PDGF-DD與NKp44相互作用促進ILC3、ILC1分泌細胞因子

Result 4

PDGF-DD介導NK細胞活化並誘導腫瘤細胞周期阻滯

已有研究表明，CD4 + Th1可以通過分泌IFN-γ和TNF-α誘導腫瘤細胞周期阻滯，而PDGF-DD與NKp44相互也會作用促進NK細胞、ILC3和ILC1分泌IFN-γ和TNF-α，因此作者推測這樣的相互作用也可能導致腫瘤細胞周期阻滯。黑色素瘤細胞在NKDD+lgG作用下增殖減少，大多被阻滯在G1期（圖6-A）。PDGF-DD與NKp44相互作用促進NK細胞分泌細胞因子，誘導腫瘤細胞生長抑制（圖6-B~D）。儘管腫瘤細胞周期阻滯，但同時也會增加IL-8、IL-6的分泌，從而誘導炎性細胞募集（圖6-E~G）。此外，在PDGF-DD的作用下，腫瘤細胞CADM1、CD112和CD95的表達上調，激活Fas途徑誘導細胞凋亡（圖6-H）。PDGF-DD與NKp44相互作用誘導NK細胞分泌細胞因子，引起腫瘤細胞周期阻滯，同時募集促炎因子，介導腫瘤免疫應答（圖6-I）。

圖6 PDGF-DD與NKp44相互作用誘導腫瘤細胞周期阻滯

Result 5

NKp44表達與膠質母細胞瘤（GBM）中不同細胞因子、細胞周期基因表達相關

那麼，PDGF-DD與NKp44相互作用在臨床中有哪些潛在影響呢？PDGF-DD一般在許多具有侵襲特徵的腫瘤細胞或基質中表達，如GBM中PDGF-DD高表達，血管厚度增加（圖7-A,B）。並且在GBM中，NKp44的表達與預後存在相關性，NCR2與IFN、CCL1、XCL1、TNFA、LTA、CSF2等細胞因子相關基因的表達正相關，與PRC1、KIFC1、CDC6等細胞周期相關基因的表達負相關，同時NKp44高表達，GBM預後較好（圖7-C～H）。

圖7 NKp44表達與惡性膠質瘤（GBM）預後的關係

Result 6

PDGF-DD與NKp44的結合抑制體內腫瘤的生長

由於NKp44僅在人類中編碼，因此研究人員構建了細菌人工染色體NCR2轉基因小鼠（NCR2-tg），以確定PDGF-DD 與 NKp44相互作用對體內癌症的影響。NKp44僅在NCR2-tg小鼠脾臟和淋巴結NK細胞上部分表達，IL-2、IL-15以及IL-1β的刺激可增加其表達（圖8-A,B）。同時，選擇B16轉移瘤模型，該模型已被證明[3]對NK細胞十分敏感，特別是其分泌IFN-γ的能力。在B16-PDGFD Sup作用下可促進NK細胞分泌IFN-γ和TNF-α，同樣這依賴於NKp44和PDGF-DD之間相互作用（圖8-C~E）。通過靜脈注射B16-PDGFD細胞2周後，NCR2-tg小鼠肺轉移減少，瘤體積減小，IFN-γ的表達增加，而如果NKp44被阻斷，肺轉移增加（圖8-F~K）。

圖8 PDGF-DD與NKp44相互作用抑制腫瘤生長

Result 7

PDGF-DD與NKp44結合能夠加強免疫檢查點抑製劑的作用

最後，研究者還將PDGF-DD與NKp44之間的作用與免疫檢查點抑製劑相結合，探究二者對於腫瘤的控制是否能夠發揮協同作用。首先檢查了NK細胞表面受體NKp44的表達，以及PD-1、TIGIT和CD96在NCR2-tg在小鼠肺和淋巴結中的表達。NCR2-tg小鼠靜脈注射B16-PDGFD細胞，肺和淋巴結中的NK細胞僅表達NKp44、CD96，不表達PD-1、TIGIT（圖9-A~C）。如果CD96被抑制，腫瘤細胞肺轉移減少，這一效果在NCR2-tg小鼠中更加明顯。同樣通過CpG-ODN治療可以加強抑制NCR2-tg小鼠皮下黑色素瘤的生長（圖9-D,E）。因此，PDGF-DD與NKp44結合能夠加強免疫檢查點抑製劑的作用。

圖9 PDGF-DD與NKp44結合增強免疫檢查點抑製劑的作用

總結與思考

人體關鍵免疫細胞—NK細胞是如何感知腫瘤的？這篇文章的創新點在於發現PDGF-DD是NKp44的配體，PDGF-DD與NKp44之間的相互作用促進NK細胞分泌IFN-γ以及TNF-α等因子，引起腫瘤細胞周期阻滯，從而控制腫瘤細胞的生長。同時證明了固有淋巴細胞（ILC3、ILC1）表面受體NKp44與PDGF-DD結合也可以分泌IFN-γ和TNF-α控制腫瘤生長。此外，PDGF-DD與NKp44結合還可以增強免疫檢查點抑製劑的作用。PDGF-DD可謂是「雙面間諜」，一方面通過自分泌或旁分泌PDGFR-β信號通路促進腫瘤生長和基質反應，另一方面可激活先天免疫，抑制腫瘤生長。

圖10 PDGF-DD與NKp44相互作用控制腫瘤生長

參考文獻：

[1] Cao Y. Multifarious functions of PDGFs and PDGFRs in tumor growth and metastasis[J]. Trends in Molecular Medicine, 2013, 19(8):460-473.

[2] Nathan C, Horton, Porunelloor A, Mathew. NKp44 and natural cytotoxicity receptors as damage-associated molecular pattern recognition receptors[J]. Frontiers in Immunology, 2015, 31(6):1-6.

[3] Takeda K, Nakayama M, Sakaki M, et al. IFN‐γ production by lung NK cells is critical for the natural resistance to pulmonary metastasis of B16 melanoma in mice[J]. Journal of Leukocyte Biology, 2011, 90(4):777-785.

稿件審閱：王愛雲

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