科學探討！細胞周期對腫瘤免疫治療的影響！

背景

儘管免疫檢查點如PD-1和其配體PD-L1的靶點治療已讓腫瘤治療獲得長久的受益，當這類靶點治療仍然對許多患者不起作用，其中的機制並不明確。今天給大家帶來一篇今年發表在Nature上的Letter，題目是《Cyclin D–CDK4 kinase destabilizes PD-L1 via cullin 3-SPOP to control cancer immune surveillance》，這篇文章就向我們闡明了其中可能的機制。

PD-L1的蛋白丰度在細胞周期進展中存在波動

已經報道過PD-L1的表達可被轉錄和翻譯後修飾調節，但不明確是否在生理條件下如在細胞周期進展過程中PD-L1的穩定性會發生變化。於是作者用藥物將細胞同步於細胞的不同周期檢測PD-L1蛋白表達情況，發現在人類腫瘤細胞株中，PD-L1的丰度波動主要在M期和G1早期達到峰值，並在G1晚期和S期出現急劇下調（Fig. 1a-d）。

Cyclin D-CDK4負性調節PD-L1蛋白的穩定性

既然PD-L1的丰度波動與細胞周期相關，那麼它的表達是否與細胞周期蛋白相關？因此，作者利用基因層面的方法在體內外都發現了細胞周期蛋白D（Cyclin D）的敲低或敲除相較於其他細胞周期蛋白更能上調PD-L1的表達（Fig. 2a-d）。

細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）在細胞周期進展過程中調節細胞周期蛋白穩定性發揮了重要作用。作者同時發現Cyclin D相關激酶CDK4的 去除或藥物的抑制也可以顯著上調細胞中PD-L1的丰度（Fig. 2e-h）。同樣，在體內實驗也得到了驗證。CDK4抑製劑的應用可以顯著上調腫瘤模型中PD-L1的蛋白水平，並減少了CD3+的腫瘤浸潤T細胞（TILs）的數量（Fig. 2i-k）。以上證實Cyclin D- CDK4在調節PD-L1水平上發揮了限速作用。

Cullin 3-SPOP是PD-L1的生理性E3泛素連接

為了理解Cyclin D- CDK4是如何調節PD-L1水平的，作者首先證實用蛋白酶體抑製劑或culIin為基礎的E3泛素連接酶抑製劑可提高PD-L1的蛋白水平（Fig. 3a）。為明確是cullin家族中哪種E3連接酶發揮作用，作者篩查了PD-L1與cullin家族中所有蛋白的相互作用，並發現cullin 3較其他cullin蛋白而言與PD-L1相互作用更顯著（Fig. 3b）。Cullin 3相關的E3泛素化連接酶可通過底物募集銜接蛋白識別底物。於是作者發現相較於其他的銜接蛋白，SPOP與PD-L1存在蛋白互作（Fig. 3c、d）。並且敲除SPOP或其與底物相作用的結構域（MATH））都可增加細胞中PD-L1的表達（Fig. 3e、f）。SPOP在人類前列腺癌中可有10-15%的突變，且大部分都存在於MATH結構域。這些腫瘤來與的SPOP突變由於不能有效地結合PD-L1，致使不能促進PD-L1多聚泛素而被降解（Fig. 3g-i）。

為證實SPOP突變在腫瘤形成中的作用，作者建立了表達野生型SPOP和突變型SPOP的腫瘤細胞株。他們發現表達突變型SPOP的細胞可顯著提高內源性PD-L1（Fig. 3j）。利用這些細胞株建立腫瘤模型，可發現表達突變型SPOP的腫瘤增長顯著快於野生型SPOP腫瘤（Fig. 3l）。利用臨床標本（原發人類前列腺癌標本），作者同樣證實了大部分SPOP突變的腫瘤中有很強的PD-L1的表達，並且其CD8+的TILs數量相較於SPOP野生型腫瘤明顯減少（Fig. 3m-o）。

Cyclin D1-CDK4調節SPOP磷酸化通過14-3-3γ來破壞其與FZR1綁定穩定蛋白

作者發現在細胞周期中SPOP蛋白的丰度也存在波動，與PD-L1蛋白水平存在負向相關，且在細胞周期中敲除SPOP也可引起PD-L1的上調（Fig. 4a）。同時，作者發現APC/C E3連接酶銜接蛋白FZR1（CDH1）在細胞周期中與SPOP蛋白水平存在負相關（Fig. 4a）。在細胞內，FZR1與SPOP存在蛋白互作。敲除SPOP上進化保守的結構域D-box可破壞FZR1與SPOP的連接，並抑制FZR1調節的SPOP多聚泛素致降解（Fig. 4b-d）。在細胞周期進展中敲除FZR1可使SPOP蛋白穩定不被降解，隨後導致PD-L1蛋白水平的下調（Fig. 4e）。這些說明FZR1是一種在SPOP蛋白穩定性負性調節中很重要的上游E3連接酶。

但是Cyclin D1-CDK4又是如何影響上述機制的呢？作者證實Cyclin D1-CDK4可直接磷酸化SPOP的Ser6位點（Fig. 4f）。並且14-3-3γ蛋白可與SPOP蛋白以磷酸化Ser6（p-Ser6）的方式作用，來破壞SPOP與FZR1的結合。抑制SPOP的p-Ser6可降低SPOP與14-3-3γ蛋白的作用，增加與FZR1的綁定（Fig. 4g-i）。在野生型SPOP的細胞中利用CDK4抑製劑可降低SPOP蛋白丰度，並上調PD-L1蛋白水平（Fig. 4j）。

很多當前的臨床研究已證實PD-1與PD-L1阻滯療效的成功與腫瘤細胞PD-L1表達水平有密切的關係。而作者已經觀察到DDK4抑製劑可增加PD-L1蛋白水平，故他們想證明是否CDK4抑製劑與PD-1-PD-L1抑製劑的聯合治療可調高其療效。在動物模型中，作者確實觀察到兩者聯合治療可顯著減緩腫瘤的進展，並提高動物的總生存（Fig. 4k、l）。

（轉化醫學網360zhyx.com）

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