核酸酶研究往事X—酶，酶的分離，酶動力學，單分子酶動力學

最新 05-18

撰文--胡振新博士（美國邁阿密大學生物化學博士、蘇州點晶生物科技有限公司董事長）

酶、酶的分離、酶動力學、單分子酶動力學

蛋白酶是催化生化反應的媒介（也有一些生化反應由核酸或核酸蛋白複合體催化），酶最初研究是從分離純化開始。蛋白酶，更普遍來說蛋白的分離純化也是經歷了相當長的時間才逐步成熟起來。

蛋白酶是催化生化反應的媒介（也有一些生化反應由核酸或核酸蛋白複合體催化），酶最初研究是從分離純化開始。

蛋白酶，更普遍來說蛋白的分離純化也是經歷了相當長的時間才逐步成熟起來。

James Sumner在這方面先驅性的貢獻值得稱道的。

James Sumner

他於1926年從一種大豆中分離出脲酶（分解尿素的酶）並得到蛋白的結晶體，這晶體是有活性的蛋白。這使得生化學家們相信，蛋白酶是可以從生物體內分離純化而且保持活性的。他由此在20年後分獲了諾貝爾化學獎。

起初分離的材料都是動物或植物的組織。

用勻漿機（比如廚房的榨汁機）打碎後離心，然後過柱子，這差不多是50多年前甚至更早的時候，比這更早的是用有機溶劑如乙醇，苯等溶液來純化，也有用硫酸銨分級沉澱後色譜分離。那時候柱子的填料解析度都不是很好，所以很長很粗的柱子就成了生化實驗室的標準配置。

在蛋白酶的含量不高的情況下，需要用放射性來示蹤蛋白純化的情況，或用放射性追蹤蛋白酶的活性。

幸虧有了蛋白超表達系統以及商業的蛋白純化儀器及填料，才使得蛋白酶的純化從一項高超的藝術變成實驗室的日常技能。

有了一定量的，高純度的酶之後，人們會想著去定量的研究酶的活性。在生化教材里會介紹到的米氏方程，就是量化研究酶的成功範例。

通過固定酶的量以及反應體系，變更底物的濃度獲得不同底物濃度下的反應速率，代入米氏方程後可以得到兩個值, Vmax以及Km。

其實這兩者的比值是大家經常忽略的，Vmax/Km表徵的是特定酶的效率。然而，人們很快發現（你也會發現），同樣來源、同樣方法、同樣儀器，甚至同樣人純化出的酶的活性，會有顯著的差異。

一個簡單的解釋是：每次純化出來的酶裡面，總有一些是沒有活性的。這些酶活性的喪失可能從細胞內合成，或者裂解，或者在純化，也可能是在保存的過程中發生的。

問題來了，我們能知道有多少酶是有活性的嗎？

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一個簡單的方法是通過Vmax的活性來推算（比如一個批次的酶的Vmax是另外一個批次的80%，就可以認為該批次里又活性的酶是另外一個批次的80%）不是不可以，但是我們只能知道相對的。（沒有辦法知道100%活性酶的Vmax）。

另外這個計算方法的一個前提是那些沒有活性的蛋白對反應是沒有影響的，這個假設不一定正確。

在米氏方程中，研究的是在穩定狀態下（Steady State）的酶反應，就是單位時間內底物的消耗或產物生成的速率是一定的。

如果我們只研究一次反應，就是讓酶和底物混合後反應一次，然後終止反應，分析得到的產物的量，就是有活性蛋白產生的。這個產物的量等於活性蛋白的量。這種研究叫前穩態(Pre-Steady State)反應動力學。

這個反應需要特定的儀器（還記得以前提到的Ken Johnson嗎，他的公司就是製造這類儀器的，英國的Applied Physics公司也是），在很快的時間內（毫秒）觀察反應的發生（底物消耗或產物生成）。

這種研究方法還可以檢測到不穩定的中間產物，這是在穩態條件下無法觀察到的（中間態產物一般不穩定，很短時間內就轉化了）。

Again，問題來了，在有活性部分的酶中，每個酶的貢獻都是一樣的嗎？或者說如果能觀察單個酶分子的話，他們是整齊劃一的催化反應的嗎？

這個很難回答，除非你能看到或者測量單個分子的反應，這幾乎是Mission impossible啊。

華裔科學家謝曉亮是這個領域研究的先行者。

謝曉亮

1998年，還在PNNL工作的他在Science發表了膽固醇氧化酶的單分子酶動力學。

在文中他把膽固醇氧化酶固定在瓊脂糖里，反應底物可以在瓊脂糖中擴散。通過熒光顯微鏡，他看到了膽固醇氧化酶在有熒光和無熒光之間變化來推知酶反應的狀況。這樣得到的信息就是酶是在催化，或者沒有催化在時間軸上的可能性分布。通過統計足夠的分子行為，可以得出大量分子在穩態情況下的催化常數。同樣的酶分子，在單分子水平下，表現出完全不同的個體化的催化行為。而在大量酶的穩態或前穩態反應中，這些個體差異的信息被平均化掉了。

謝後來去了哈佛，他實驗室的博後Von Oijen把單分子的實驗應用於核酸複製系統，得到了一些很有意思的發現。