微生物組間差異分析之LEfSe分析

LEfSe分析，可以分析組間菌群差異，找出各組間差異的微生物種類，有助於開發biomaker等研究，因此LEfSe分析在微生物相關文章中經常出現。我們今天來詳細講解一下LEfSe分析的原理及圖表解讀。

LEfSe分析原理

Step1.首先在多組樣本中採用非參數因子Kruskal-Wallis秩和檢驗檢測不同分組間丰度差異顯著的物種；也就是圖中按class1 和class2兩個大的分組，每一行都進行檢驗，初步得到差異物種，通過檢驗的打鉤進入step2檢驗；

Step2.再利用Wilcoxon秩和檢驗，對每一組中的亞組進行兩兩檢驗，具有顯著差異的再進行下一輪檢驗。

Step3.最後用線性判別分析（LDA）對數據進行降維並評估差異顯著的物種的影響力（即LDA score）。

前兩步的Kruskal-Wallis秩和檢驗、Wilcoxon秩和檢驗比較簡單，類似T檢驗或者方差檢驗等，只不過T檢驗和方差分析為參數檢驗（要求數據符合方差齊性、正態分布），而在微生物多樣性分析中，樣品物種丰度分布不確定，多採用非參數檢驗，所以採用非參數的Kruskal-Wallis秩和檢驗、Wilcoxon秩和檢驗。比較複雜一點的就是最後的LDA分析。

LDA是一種監督學習的降維技術，也就是說其數據集中的每個樣本是有類別輸出的。是在目前機器學習、數據挖掘領域經典且熱門的一個演算法這點和PCA不同。PCA是不考慮樣本類別輸出的無監督降維技術。LDA是有監督的，所以LDA演算法可以很好的利用樣本的分組信息，得到的結果更可靠，這就是LDA分析優勢。理解了LDA分析的原理，就不難理解LEfSe的分析結果了。

LDA分析原理：

LDA是一種經典的降維方法線性判別分析（Linear Discriminant Analysis）。LDA的思想可以用一句話概括，就是「投影后類內方差最小，類間方差最大」。什麼意思呢？ 我們要將數據在低維度上進行投影，投影后希望每一種類別數據的投影點儘可能的接近，而不同類別的數據的類別中心之間的距離儘可能的大。

可能還是有點抽象，我們先看看最簡單的情況。假設我們有兩類數據 分別為紅色和藍色，如下圖所示，這些數據特徵是二維的，我們希望將這些數據投影到一維的一條直線，讓每一種類別數據的投影點儘可能的接近，而紅色和藍色數據中心之間的距離儘可能的大。

上圖中提供了兩種投影方式，哪一種能更好的滿足我們的標準呢？從直觀上可以看出，右圖要比左圖的投影效果好。因為右圖的黑色數據和藍色數據各個較為集中，且類別之間的距離明顯，而左圖則在邊界處數據混雜。以上就是LDA的主要思想了，當然在實際應用中，我們的數據是多個類別的，我們的原始數據一般也是超過二維的，投影后的也一般不是直線，而是一個低維的超平面。

LEfSe分析結果：

LDA值分布柱狀圖：

圖中展示了LDA Score大於設定值的物種(less_strict 設為2；more_strict 設為4)，即組間具有統計學差異的Biomarker。展示了不同組中丰度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的顯著性（即為 LDA Score）。

進化分支圖：

在進化分支圖中，由內至外輻射的圓圈代表了由界(單個圓圈)至屬（或種）的分類級別(不同的分類水平下圓圈的層數不同，下圖為order水平下進化圖，所以有4層)。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對丰度大小呈正比。著色原則：無顯著差異的物種統一著色為黃色，差異物種 Biomarker跟隨組進行著色，紅色節點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，其它圈顏色意義類同。圖中英文字母表示的物種名稱在右側圖例中進行展示。

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