細胞計數及半數感染量

除雞胚繁毒外，實驗室目前更多的是採用細胞繁毒，細胞繁毒具有易於收集，病變明顯，易於觀察的特點，無需進行第二實驗系統即可確定病毒存在與否，同時可以用於病毒毒力測定（ID50，半數感染劑量）。

細胞接種病毒需在生物安全櫃中進行，接種前進行紫外線消毒。實驗開始前，先把所有用品酒精消毒後放入生物安全櫃，吶，就像下面這個帥氣小哥哥那樣：

準備就緒之後，從培養箱拿出培養好的細胞，這個就是細胞培養專用培養瓶：紅色液體是含有胎牛血清的培養液，細胞是貼在瓶壁上生長的，肉眼觀察似毛玻璃狀：

倒掉細胞培養液

準備好0.25%胰酶溶液：

先向培養瓶中加入1ml胰酶，消化洗脫細胞

再加入3ml 培養液中和胰酶的消化作用，製成細胞懸液：

混合均勻之後吸取10μl, 與70ul 台盼藍（0.4%濃度）混勻，分別取10μl混合液滴入細胞計數板兩端的計數池中，

細胞計數板結構示意圖如下（正面觀與側面觀）（圖片來自網路）：

示意圖中間黑色方塊是兩個計數池

計數池在顯微鏡下放大示意圖如下：（圖片來自網路）

每個計數池包括4個用於計數的大方格（每個大方格邊長為1mm, 厚度為0.1mm, 故一個大方格所容納的液體體積為0.1mm3,相當於10-4ml), 每個大方格又包括16個小方格。計數時候用計數器逐個計數，採取弓字形順序以免漏記。如果有細胞在方格邊緣線上，四個邊長只記其中兩個邊長以減少誤差。（細線方格只起隔離作用，其中的細胞不計數）。健康完整的細胞不能被台盼藍染色，在顯微鏡下呈現透明狀，死細胞會被染成藍色，計數時只記活細胞，不記死細胞

細胞計數與濃度換算關係：顯微鏡下將兩個計數池裡共8個大方格里的細胞總數（假設為200個）除以8即為每個方格內的細胞數目；而由於細胞懸液與台盼藍進行混合時候是按照1：7比例進行，相當於細胞被稀釋為原來的八倍，故原始細胞懸液中的細胞濃度應該是每個大方格內細胞濃度的8倍（200/8 Ⅹ8=200個/0.1mm3=200/10-4ml=2Ⅹ106/ml），故計數總數即為原始細胞濃度的10-4

細胞培養用96孔培養板：

先將按照實際需要稀釋好的細胞懸液加入加樣槽中：

用多道移液槍給培養板每孔加入100μl細胞懸液：

鋪板細胞濃度一般為1~3Ⅹ105左右，可根據實際情況進行調整，一般以沉降後細胞佔滿40-50%面積為宜：剛鋪好時顯微鏡下觀察細胞濃度一般較低，待充分沉降後（一般5-10min）再觀察，如密度仍然過低（如下圖），需要進行二次鋪板（吸去上清，重複鋪板過程）

板子鋪好後放入細胞培養箱進行培養，待細胞完全鋪滿板子後即可接種病毒，接種病毒時，先將病毒液用細菌濾器過濾以除去雜質和可能的細菌污染：

然後將96孔板中培養液棄去，將病毒濾液用新鮮的細胞培養液倍比稀釋為12個濃度如下：

每一稀釋濃度的病毒液加入同一列8個孔中，每孔加入100μl, 。接毒完成後置於培養箱進行培養，病毒與細胞充分接觸2小時：

棄去上清液，重新加入新鮮培養液孵育，至出現明顯細胞病變，將能夠引起半數細胞病變的病毒稀釋濃度劑量記為病毒的半數感染量。

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感謝神農架林區團委李翼風書記光臨檢驗檢測中心關懷慰問、住建委美女小學妹陳芳送來超美鮮花，雖身在異鄉，亦溫暖相伴。。。。。。

感恩，感謝！

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