一次編輯數百種基因！遺傳學大牛George Church發布基因編輯新方法

基因編輯技術幫助人們實現了「編輯生命」的願望，但該技術自身存在的局限性也限制了其廣泛應用，此前人們的研究熱情也多集中在編輯的效率、準確性與安全性，但常規的基因編輯技術在一個反應中僅能對一個或數個基因進行操作，且通常會在基因組中留下額外的不需要的序列修改，在大型研究中，已有的基因編輯技術遠遠無法滿足大量不同基因的編輯需求。

為解決上述問題，哈佛大學George Church教授領導的研究團隊開發了一種基於CRISPR-Cas9的新型高通量基因編輯方法：guide+donor，該方法可以在單個釀酒酵母中同時精確改變數百個不同基因，編輯效率達到80％至100％，還能在生物體內選擇特定行為細胞，進行定向基因編輯和修復。guide+donor除幫助構建大型文庫外，還能進行基因功能分析，發現一些未知的基因突變和功能。

5月21日，相關研究成果發表在著名學術期刊Nature Biotechnology上，文章題為「High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast」。

George Church教授

人類的基因變異通常是點突變導致，為在不干擾其他潛在變異的情況下重構釀酒酵母中的某些變異，CRISPR-Cas9技術藉助sgRNA精確靶向DNA目標序列，在Cas9酶切割其靶序列後，在一個被稱為同源定向重組(HDR)的過程中，藉助攜帶目的基因突變的供體模板序列來修復基因。

研究人員表示，新的研發策略是將sgRNA、供體模板序列與一個穩定可遺傳的染色體外DNA分子連接起來，組成guide+donor組合，這能在一個反應中構建大型變體文庫，同時將多個sgRNAs和供體模板大量傳遞到酵母細胞，還能定向修復斷裂的DNA雙鏈，並通過NGS技術識別被編輯的細胞。

技術優勢：

在一個反應中快速構建大型DNA變異文庫

在一個反應中同時提供guide和donor，防止無效修復和非生產性修復。

含有guide+donor組合的質粒可以作為追蹤基因編輯細胞的獨特條形碼，利用NGS技術可以進行高通量分子表型鑒定。

guide+donor基因組編輯平台，來源：

Nature Biotechnology

在證明過程中，該團隊首先關注了酵母中編碼DNA解旋酶和修復酶SGS1的單個高保守基因序列，然後他們用一種有毒試劑破壞了攜帶guide+donor文庫的酵母細胞DNA，然後對存活細胞進行DNA測序。最終他們發現了影響SGS1特徵的基因突變，這些特徵對於受損DNA的修復至關重要，並且能影響細胞持續存活。

隨後，該研究團隊使用guide+donor方法剔除了酵母全基因組中的315個基因，它們可以編碼分散在整個基因組中的小型開放閱讀框架（smORF，長度

在檢測的315個smORF中，研究人員發現68個是在細胞適應性存活中起重要作用，這與傳統ORFs功能認知相反，因為在相同條件下，307個ORF中的104個會參與細胞生長。通過分析這些基因對酵母在不同脅迫環境下存活的影響，發現可以將未明確的基本功能分配到特定的smORF，為基因功能分析打開了新的大門。

Church表示，新的方法不僅能夠更高效、更準確地在酵母中進行高通量「功能基因組學」研究，還能模擬、檢測酵母細胞中與特定性狀或功能紊亂相關的低頻基因突變，並找出哪些與疾病實際相關。此外，該方法除了可以在龐大的基因家族中挖掘新的基因和功能外，還能研究基因組中的非編碼序列，提高我們對基因調控和染色體生物學的理解。

參考文獻：

1.Profiling the genome hundreds of variations at a time

2.High-throughput creation and functional profiling of DNA sequence variant libraries using CRISPR–Cas9 in yeast

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