Cell子刊：新型高效精確的基因靶向整合策略

本文轉自中科院神經科學研究所

該研究設計了一種新型基因靶向整合策略Tild-CRISPR，它可以在小鼠和人的細胞中實現高效精確的基因敲入。Tild-CRISPR不僅適用於高效地構建小鼠動物模型，同時為研究體內的基因功能以及開發潛在的基因療法提供新思路。

CRISPR/Cas9介導的基因編輯方法極大地促進了體內和體外的轉基因靶向整合。傳統的同源重組（HR）介導的整合策略在動物胚胎和組織中效率低下。非同源末端接合（NHEJ）和微同源臂介導的末端接合（MMEJ）策略只能在某些系統內提高效率。該研究團隊之前的研究結果表明，以同源臂介導的末端接合（HMEJ）為基礎的策略可以在小鼠胚胎以及小鼠體內實現高效地靶向整合。但是實現高效地構建條件性基因或大片段基因敲入小鼠模型，以及在人胚胎上實現高效靶向整合等仍存在技術壁壘。

在本工作中，研究團隊基於CRISPR/Cas9系統，設計了一種新的靶向整合策略Tild-CRISPR (Targeted Integration with Linearized dsDNA-CRISPR)，通過PCR擴增或者精確酶切獲得含有800bp同源臂的轉基因供體與Cas9 mRNA以及single-guide RNA一起注射到小鼠受精卵中。相比現有的靶向策略，該方法在注射的小鼠胚胎中表現出最高的敲入效率，並成功地在6個不同的位點分別獲得了從0.8 kb到6.0 kb 不同長度外源基因的敲入小鼠。同時，與HR或HMEJ介導的方法相比，Tild-CRISPR在子宮內電轉實驗中顯示了更強大的體內DNA 敲入能力。更重要的是，在人類胚胎中，Tild-CRISPR方法的基因敲入效率比HR介導的方法高12倍，這極大地促進了人類胚胎髮育的研究以及疾病突變的修復。

綜上所述，該工作建立了一種新的基因靶向整合策略Tild-CRISPR，通過體外PCR擴增或者精確酶切獲得含有800bp同源臂的線性轉基因供體，可以在小鼠和人的細胞中實現高效的DNA靶向整合，為研究體內的基因功能和開發潛在的基因療法提供了新的思路。

該項工作由神經所助理研究員姚璇博士、博士研究生王興與仁濟醫院生殖醫學中心章美玲博士在神經科學研究所靈長類疾病模型研究組楊輝研究員與山東大學附屬生殖醫院、上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院陳子江教授的指導下完成。課題組其他成員積极參与，並得到生化細胞所孟飛龍研究員、神經所實驗動物平台、分子細胞平台與光學成像平台的大力協助。本工作得到國家科技重大專項，上海市科學技術委員會項目，國家自然科學基金會，上海市輔助生殖和生殖遺傳重點實驗室，國家研究和發展計劃等項目的資助。

研究模式圖：Tild-CRISPR，通過體外PCR擴增或者精確酶切獲得含有800bp同源臂的線性轉基因供體，可以在小鼠胚胎，小鼠大腦以及人胚胎中實現高效的DNA靶向整合。

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