GoldCLIP：研究蛋白和核酸互作的新技術

責編丨迦 漵

核酸與蛋白質的互作在生物體內發揮著不可或缺的作用。傳統上研究核酸和蛋白質互作主要有兩種方法。其一是RIP技術（RNA Immunoprecipitation），其二是CLIP技術（UV crosslinking and immunoprecipitation）。

RIP技術通過純化RNA和RNA結合蛋白的複合物來研究RNA結合蛋白所結合的RNA。如表1所示，其優點是步驟少，操作簡單。其主要缺點在於存在細胞裂解後核酸飄逸的現象，因此在RIP的數據中假陽性的結果比較多，而且也無法得知RNA和蛋白的具體結合位點。為了克服RIP的缺點，2003年，Robert B Darnell實驗室最先發表了通過紫外交聯的方法來研究RNA和蛋白質互作的相關文章（Science，2003），即CLIP技術（基本流程如圖1所示）。其優點是得到的數據特異性高，同時能夠得知蛋白和核酸交聯的位置。其缺點也很明顯就是步驟多，操作的要求極高。

圖1 CLIP技術的基本操作流程：（1）通過紫外光照射使蛋白和RNA進行交聯；（2）裂解細胞後，對複合物進行RNA酶消解，截短複合物中RNA的長度；（3）體外沉澱蛋白質核酸複合物；（4）在RNA的3』端加上接頭；（5）在RNA的5』端標記上同位素32P；（6）通過SDS-PAGE膠和轉膜到硝酸纖維素薄膜上純化蛋白RNA複合物，並通過放射自顯影切膜回收蛋白RNA複合物；（7）降解蛋白回收RNA；（8）在RNA的5『端加上接頭；（9）反轉錄成cDNA文庫。

為了提高CLIP技術的效率，中科院生物物理研究所俞洋組改進了傳統的CLIP技術，提出了GoldCLIP技術(Gel-omitted and ligation-dependent CLIP)。通過利用Halo-tag的特性簡化在體外純化蛋白質和核酸複合物的步驟，從而省略了體外膠膜純化蛋白RNA複合物的步驟。在體外，Halo-tag是經基因工程改造的脫鹵素酶，其活性中心只能與含有鹵素的配體以共價鍵的形式相互結合，而且該共價鍵不能打開。因此，當將靶蛋白和Halo標籤融合後，含有Halo-tag的蛋白/RNA複合物就可以與含有鹵素配體的磁珠共價偶聯。這樣就能在體外進行嚴格地洗滌，從而簡化了膠膜純化的步驟。Halo標籤的分子量為33kDa，可以結合在靶蛋白的N端或者C端。該融合蛋白可以在原核或真核表達系統中表達。

GoldCLIP的流程如圖2所示。首先通過磁珠分離蛋白RNA複合物，然後在RNA的3』端加上接頭，接著通過蛋白變性劑，如Urea，Guanidine，SDS等，對蛋白RNA複合物進行洗滌，最後得到高純度的蛋白/RNA複合物。然後降解蛋白，回收RNA。將RNA轉錄成cDNA後進行建庫、測序，即可得到該蛋白在體內的RNA結合位點。

圖2 GoldCLIP的簡要流程圖

研究人員用GoldCLIP技術研究了PTB蛋白（polypyrimidine-tract binding protein）並和前人的加過進行了比較。PTB蛋白是一個經典的RNA結合蛋白，前人研究表明PTB通過結合CU-rich的motif來調控對體內RNA的加工。在文章中，他們使用了兩種紫外交聯方式對PTB蛋白進行了交聯，分別是UVC（波長254nm）和UVA（波長365nm）。結果如圖3所示，GoldCLIP技術可以較好的重複以前的文獻發表的實驗結果。因為使用了Halo-tag，在磁珠共價結合Halo蛋白後，可以直接在完全變性的條件下對複合物進行純化，從而省略了同位素標記以及跑膠轉膜等繁瑣步驟。因此，GoldCLIP操作簡單，能有效地等到高度可重複的數據，是值得大家關注和推廣的技術。

圖3 GoldCLIP識別的PTB結合位點。

GoldCLIP技術近日以「GoldCLIP: Gel-omitted Ligation-dependent CLIP」為題發表在Genomics, Proteomics & Bioinformatics雜誌上，文章通訊作者為中科院生物物理研究所俞洋、復旦大學生命科學學院麻錦彪、劍橋大學Gregory J. Hannon以及武漢大學周宇。

參考文獻

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