絕對精準定量的數字PCR

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自1985年Kary Mullis發明PCR技術以來，PCR及時一直生物醫學領域中重要的實驗方法。隨著分子生物學技術的發展，熒光定量PCR是目前的主要核酸定量方法。數字PCR(digital PCR, dPCR)是近年來發展起來的新技術，由於其不需要建立標準曲線，可以對核酸的拷貝數進行絕對定量，因此具有更廣泛的應用前景。

數字PCR技術的原理

數字PCR(digital PCR, dPCR)的原理並不複雜，dPCR是一種對含有核酸分子的標準反應體系進行有限稀釋，使稀釋後的每個反應含或不含一個或者多個拷貝的待檢靶分子（DNA模板），實現每個反應為一個獨立的PCR反應器，經PCR擴增後對每個獨立反應進行檢測，並以終點信號的有或無作為判斷標準（有熒光信號的微滴判讀為「1」，無熒光信號的微滴判讀為「0」）。最後，根據泊松分布原理及陽性反應器的比例，利用分析軟體計算待檢靶分子的濃度或拷貝數，從而獲得最終結果。

dPCR的特點是靈敏高、定量精確、檢測的線性範圍寬、特異性好、費用適中，是一種很有前途的分子定量檢測手段。dPCR與傳統PCR、定量PCR相比，定量結果不再依賴於Ct 值，直接給出靶序列的起始濃度，實現真正意義上的絕對定量，因此這項技術在極微量核酸樣本檢測、複雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面的應用優勢已被普遍認可，而其在基因表達研究、microRNA研究、基因組拷貝數鑒定、癌症標誌物稀有突變檢測、致病微生物鑒定、轉基因成分鑒定、NGS測序文庫精確定量和結果驗證等諸多方面具有的廣闊應用前景已經受到越來越多的關注。

dPCR基本原理（微滴式）

數字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數，因此無需依賴於對照樣品和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測；此外，由於數字PCR在進行結果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態，因此也不需要檢測熒光信號與設定閾值線的交點，完全不依賴於Ct值的鑒定，因此數字PCR的反應受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應抑制物的耐受能力大大提高；數字PCR實驗中標準反應體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數字PCR技術也特別適合在複雜背景中檢測稀有突變。

數字PCR的產生和發展

20 世紀末，Vogelstein 等在檢測糞便中進行癌變組織脫離細胞的BRAF特異突變型基因時，因受到體細胞基因的干擾，而碰到檢測靈敏度和檢測解析度的瓶頸，而採用了在384孔板中對每個反應孔的樣品量進行極限稀釋並增加反應孔數進行檢測的方式，從而提出了數字式PCR的概念，同時也提出如果採用更多孔板其檢測靈敏度會更高，從而指出了數字PCR系統的發展方向。

雖然dPCR技術的原理並不複雜，然而早期在第一步的樣品稀釋的環節上卻遇到了相當大的困難，在稀釋的數量和均勻性上都很難達到要求，這一困難極大地限制了dPCR技術的發展。直到近幾年，dPCR技術終於突破了技術瓶頸，實現了商業化產品，目前主流核酸樣品稀釋分散技術主要包括基於微孔板，油包水微滴，微流控晶元等。

基於微孔晶元的數字 PCR 檢測

數字PCR技術的應用領域

1.稀有變異檢測

從外周血內獲得分子生物標記物、進行特異突變篩查、監測病程是醫療保健的一個發展方向。這要求檢測體系(探針和引物)必須保證能在高背景野生型等位基因存在的條件下檢測到低丰度的突變基因。由於數字PCR降低了對反應擴增效率的要求，採取終點法判讀的方法，數字PCR可以很好的勝任稀有變異檢測的工作，同時也減少了引物設計過程中由於擴增效率不合要求而造成的浪費(時間、樣品、耗材等等)。

2. 拷貝數變異

雖然生殖系或體細胞拷貝數變化是否具有臨床意義需要取決於具體臨床情況，但CNV改變基因表達水平卻有十分重要的臨床意義。數字PCR具有準確性和精確性的特點，這使得其可以在CNV研究中發揮重要的作用。在有已知拷貝數的內參基因的前提下，數字PCR不但可以清晰區分一個或者兩個拷貝，更可以對多拷貝基因進行分析，例如，五個或者六個拷貝。在這一點上，相比於包括qPCR在內的常規方法，數字PCR優勢明顯。

3. 樣本需求量低

數字PCR的一個主要優勢是所需樣本量很低，這對於一些臨床樣本來說特別重要，尤其是樣本珍貴或者樣本核酸存在降解的情況下。目前很多基因組研究方法，例如CGH晶元、二代測序等，在實驗之前都需要對有限的臨床樣本進行擴增以保證達到實驗樣本量的要求。然而，實際情況是，預擴增會引入偏向，無法保證不改變樣本內待測基因的相對丰度，對實驗結果影響的嚴重程度取決於不同的應用。 數字PCR樣本需求量低的特性可以避免由於預擴增所引入的實驗誤差，更好的實現實驗的精準性和可靠性。

4. 分析便捷

數字PCR有或無的結果判讀非常簡潔。對於相對定量分析來說，只需使用泊松原理將陰性/陽性微滴的比例轉換成表達丰度、使用一個或多個內參基因進行均一化後即可完成分析。

5. 與二代測序整合

如何在臨床領域發揮NGS的巨大優勢是一個重要的問題。數字PCR是一項非常有用的互補型技術。例如：使用數字PCR檢測患者特異性標記物，與腫瘤配對末端測序實驗結果進行相互驗證，並且可以進行NGS文庫的製備和定量。

數字PCR為分子生物學、微生物學、液體活檢等領域提供了新的檢測方法和實驗思路。從應用範圍和實驗成本角度來看，數字PCR不可能完全取代熒光定量PCR，但從重複性、準確性和樣本量方面可以給PCR技術帶來重要的補充。

參考文獻：

1. Vogelstein, B. &Kinzler, K.W. (1999). Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,96(16):9236-9241.

2. M Baker. (2012). Digital PCR hits its stride. Nature methods, 9(6 ): 541-544.

3. V Marx. (2014). PCR: paths to sensitivity. Nature methods , 11(3): 241-245.

4. 詹成, 數字PCR技術的發展和應用. 復旦學報（醫學版）, 2015,11,42(6):786-788.

5. 洪來法. 基於核酸精準檢測的微滴式數字PCR檢測技術.

6. 李春勇. 數字PCR技術原理及應用.

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