Nanopore測序精準鑒定基因組結構變異，讓全外顯子組檢測陰性案例得到確診，為PGD提供重要參考

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中南大學生殖與幹細胞工程研究所、中信湘雅生殖與遺傳專科醫院的張前軍研究員與希望組首席科學家王凱教授等帶領的團隊採用Nanopore測序技術，在一例全外顯子組檢測陰性的患兒中精準鑒定出基因組結構變異，不僅對患兒進行了確診，同時還明確了結構變異的來源，從而為胚胎植入前遺傳學診斷提供了重要參考，幫助夫婦成功生育一名健康寶寶。該研究於2018年5月21日在線發表在BioRxiv上。

2018年5月21日，BioRxiv在線發表了一篇題為《Long-read sequencing identified a causal structural variant in an exome-negative case and enabled preimplantation genetic diagnosis》的研究成果，本研究由中南大學生殖與幹細胞工程研究所、中信湘雅生殖與遺傳專科醫院的張前軍研究員與希望組首席科學家王凱教授等帶領的團隊合作完成。研究採用Nanopore測序技術在一例全外顯子組檢測（WholeExome Sequencing,WES）陰性的患者中精準鑒定出基因組結構變異（Structural Variations,SVs），不僅對患者進行了確診，同時還明確了結構變異的來源，從而為胚胎植入前遺傳學診斷（PreimplantationGeneticGiagnosis，PGD）提供了重要參考，幫助夫婦成功生育一名健康寶寶。

研究背景

近年來WES已成為孟德爾遺傳病的主流臨床研究或檢測方法，然而，由於二代測序技術的讀長較短，WES的大部分檢測結果（約60-70%）為陰性。即使基於二代測序的全基因組測序（WholeGenomeSequencing, WGS）似乎也不能顯著提高診斷率，且性價比不高。因此，WES / WGS陰性病例已成為目前遺傳病臨床研究或診斷的巨大挑戰，其中最主要的原因是，基於二代測序技術的WES和WGS對結構變異等複雜區域的檢測常常無能為力。

長讀長測序技術（也稱為第三代測序技術），如Oxford Nanopore和 PacBio SMRT測序技術，憑藉超長讀長、極低GC偏好性、直接檢測甲基化等優勢，突破二代測序技術瓶頸，彌補了基於短讀長測序的WES / WGS的不足，可精確檢測結構變異、串聯重複序列等，從而提高更多疾病的診斷率。

研究內容

2017年，12歲男童因肝脾腫大和生長遲緩隨父母到中信湘雅生殖與遺傳專科醫院就診。父母期望患兒能得到確診，並希望通過第三代試管嬰兒技術孕育健康後代。

「先證者被確診」之路

臨床表型及生化檢查

娃娃臉（Doll-like facies，HP:0000295）

腹部隆凸（Protuberant abdomen，HP:0001538）

肝脾腫大（Hepatosplenomegaly，HP:0001433）

臀部和手腕錶現為骨質疏鬆（Osteoporosis，HP:0000939）

空腹血糖值為0.17 mmol/l，達到危險的低值。膽固醇、甘油三酯和氯的水平不正常。肝臟功能檢查結果顯示，轉氨酶升高(AST/ALT)和其他生化異常。血清銅和銅藍蛋白含量正常。

通過臨床表型及生化檢查，初步判斷該患兒可能患有糖原累積病Ia型（GSD-Ia）。

全外顯子組檢測

為驗證臨床上的初步判斷，首先對患者進行全外顯子組測序，結果顯示，患者的G6PC基因上存在一個純合錯義突變(c.326G>A)，該位點在蛋白序列中高度保守（Fig.1）。根據OMIM記載（Fig.2）：染色體17q21上編碼葡萄糖-6-磷酸酶的G6PC基因上的純合或複合雜合突變可能引起GSD-Ia，遺傳模式為常染色體隱性遺傳（AR）。結合生物信息分析軟體InterVar的預測結果，按照ACMG 2015版指南將該變異定級為likely pathogenic。

Fig.1

G6PC基因編碼的蛋白質序列在該位點為高度保守區域

Fig.2 OMIM對

G6PC基因的介紹

結合家族史問詢，推測患者的父母皆為G6PC基因位點變異攜帶者，患者為純合變異，譜系圖如下（Fig.3）：

Fig.3 結合家族史問詢和疾病AR遺傳模式的譜系圖

一切都在按部就班的進行，只要最後一步Sanger驗證結果符合該變異的遺傳模式，一份陽性報告就可以成文了。

然而，一代驗證結果（Fig.4）卻與推測不符：只有母親攜帶該位點的雜合變異，父親未攜帶變異。那全外顯子組檢測到的患者的純合變異從何而來？

Fig.4 患者及其父母的Sanger驗證結果

難道是由於父親存在生殖細胞嵌合現象？

於是又對父親的血液和精子DNA進行了Sanger測序驗證，然而測序結果並沒有給出確定的答案：在父親精子DNA的c.326位點出現了一個小的A等位基因峰和一個更小的C等位基因峰（Fig.5 右）。這？？？

Fig.5 患者之父 血液（左）和精子（右）DNA 的Sanger驗證結果

長讀長測序鑒定出結構變異

在該案例中，WES無法解釋致病變異和遺傳模式的衝突、無法確定變異來源、無法精確診斷致病變異。於是研究人員採用最新的Nanopore長讀長測序技術，對患者進行全基因組檢測，在~12×的低測序深度下，在患者G6PC基因的一個等位基因上檢測到長達7Kb的缺失突變：chr17 g.41049904_41057049del7146 (GRCh37)，有4條Nanopore reads能對該缺失突變進行支持（Fig.6）。通過定量RT-PCR和Sanger測序也很好地驗證了這段缺失變異（Fig.7）。

Fig.6 4條Nanopore reads顯示的缺失區域

Fig.7 定量RT-PCR和Sanger測序驗證結果

該缺失變異覆蓋了G6PC基因的5』調節區域、外顯子1、內含子1、外顯子2、內含子2的一部分，共計7125 bp，最終導致了基因功能喪失（loss of function）。

最終診斷結果

胚胎植入前遺傳學診斷

為了能夠生育一個健康的孩子，該家庭選擇了進行試管嬰兒。當四個胚胎髮育到囊胚期時，對胚胎進行植入前遺傳學診斷（PGD），並根據之前明確的錯義突變（c.326G>A） 和缺失變異（chr17 g.41049879 _41057003del7125)，通過PCR判斷出四個胚胎均沒有缺失變異，但是四個胚胎均為錯義突變的攜帶者。最後，通過綜合考慮，將最安全的胚胎植入到母體內。

母親孕19周時，採集羊水進行基因檢測，檢測結果證實了胎兒是錯義突變的攜帶者

研究結論

基於二代測序的WES/WGS的陰性報告，一直是臨床研究的重點和難點。本文開拓性的應用Nanopore長讀長測序技術，突破二代測序檢測基因結構變異的技術瓶頸，不僅使患兒得到確診，也為患者父母再次生育進行PGD時提供了重要參考，從而助力孕育更健康的寶寶。

希望組

作為全球最大三代測序應用公司、全球最大的Oxford Nanopore測序中心，致力於研發和推廣長讀長測序技術在醫學中的應用，目前已重磅推出「華夏萬人SV」，旨在構建中國健康人群高分辨基因組結構變異圖譜、單鹼基精確度的DNA甲基化圖譜，彌補目前基因組資料庫的空白，進而通過對大規模的疾病群體進行基因組結構變異分析，明確廣泛的疾病和病症相關的罕見遺傳變異，這將對中國人群基因組學研究、遺傳性疾病研究、精準醫療應用等領域產生重要的科學及臨床價值。

參考文獻

Hefan Miao, Jiapeng Zhou, Qi Yang, et al. Long-read sequencing identified a causal structural variant in an exome-negative case and enabled preimplantation genetic diagnosis. bioRxiv preprint first posted online May. 21, 2018.

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