通過技術創新驅動CAR-T製造優化

Philip H Coelho

Philip H Coelho先生是博雅控股集團旗下熱動力醫療（ThermoGenisis, 納斯達克股票代碼：KOOL）的首席技術官(CTO)。他是一位工程師，也是一位發明家，已獲得40多項與細胞分選、細胞清洗、自動化細胞凍存、低溫自動化機械技術、血液內凝血蛋白的收集相關的美國專利。

在職期間， Coelho先生開發了Thermoline超快速血漿冷凍機和解凍機、CryoSeal自動化系統（將手術患者血液製成纖維蛋白膠）、BioArchive?機械系統（用於胎盤/臍血造血幹細胞及祖細胞（HSPC）的程序降溫和低溫凍存）以及AutoXpress?系統（將臍血中的HSPC無菌自動收集至25ml雙室冷凍袋）。BioArchive?系統以及AutoXpress?系統已在全球樹立臍血處理以及存儲的GMP最高標準。

9年來，Coelho先生與其工程師和細胞生物學家精英團隊開發了符合GMP規範的新一代可編程系統，能提高從外周血、胎盤/臍帶血、骨髓和白細胞產品中分離純化干/祖細胞和免疫細胞的速度和效率。這些研究項目演化成為CAR-TXpress?技術平台，這是一種自動化、全封閉的生物製造平台，能夠大規模生產高質量、臨床級CAR-T細胞。

Q： CAR-T生產工藝中哪些環節可以實現自動化或半自動化？

Coelho先生：CAR-T細胞生產工藝的關鍵環節可以實現自動化，現如今行業迫切需要推進生產自動化。值得注意的是，每一次的白細胞去除術（leukapheresis）都能從健康供體中獲取約5×109個T細胞。這個數量遠高於實際注入患者體內的基因修飾T細胞的數量（諾華Kymriah?：0.2-5×106/kg，凱特Yescarta?：2×106/kg）。更讓人擔心的是，採用當前手工生產工藝，可輸注的T細胞數量會隨著一周或更長的擴增周期而大量損耗。

整個工藝流程均會發生關鍵細胞損耗，但最嚴重的可能發生在第一階段——從患者血液中收集單個核細胞（MNC），進行T淋巴細胞分離。常年在實驗室生產CAR-T細胞的專業人員告訴我們，當前的手工工藝可導致細胞損耗率高達50%至90%，因此將此生產環節自動化尤為重要。

優良的自動化工藝應能夠在去除血小板、紅細胞、粒細胞以及清洗冷凍保護劑二甲亞碸（DMSO）的同時，將MNC損耗最小化，獲取純化的MNC，從而有效分選T細胞。成功的自動化系統還需要克服因不同來源的患者血液所帶來的嚴重併發症的風險（現采或凍存的外周血或白細胞去除術的產品）。

下一個需要自動化的環節是從MMC中分選T淋巴細胞。自動化分選必須獲取高純度T細胞，以求最大限度提高下游處理效率。抗體分選後殘餘在T淋巴細胞群中的單核細胞會降低轉導效率和T細胞的擴增。此外，如果單核細胞殘餘量較大（常發生於傳統磁珠分離過程），採用人工方法清除這些單核細胞亦無法避免目標T細胞再次損耗。

獲取高純度T細胞後，優良的自動化激活工藝可避免再次引發併發症。例如，某些用於激活的磁珠產品本身就是個大問題， 為此FDA要求臨床醫師在清洗前後對磁珠進行計數（磁珠數量常大於需要激活的細胞量）。當然，FDA不希望與細胞大小相同的磁珠隨細胞輸入患者體內。

Q：您對企業採用自動化設備有何建議，理想情況下，這種投資何時能見到回報？

Coelho先生：如果是生產小部件，那麼簡單的投資回報（ROI）分析就可以。但我們並不是在生產小部件,而是在努力收集足量具有可行性的基因修飾T細胞，用來拯救生命，因此患者的生存率才是分析的關鍵。當然，矽谷製造模式值得參考：製造商升級晶元自動化生產工藝後，生產效率高、生產成本降低，同時產品質量也得以提升。

然而，晶元製造商是不會遇到生物製藥領域這種複雜問題的——患者提供的原始細胞在數量和質量上差異很大，生產設備的各個自動化環節需要在降低目標成本的同時，既要縮短生產耗時，又要提升細胞回收率、活率、純度及穩定性。

目前，將患者細胞輸入自動化生產設備系統後，我們並不能隨即從設備另一埠輕易獲取可用於治療的CAR-T細胞產品。但是，在生產工藝流程中系統地引入自動化模塊將能簡化現有生產工藝，從而更易實現整個工藝流程的全自動化。

Q：與非自動化製造方法相比，CAR-TXpress?系統性能如何？

Coelho先生：我們相信，與傳統手工生產系統相比，我們的自動化模塊將在MNC純化、細胞清洗、抗體分選以及T細胞激活方面表現更佳，並且大幅縮短處理時長。

有文獻指出，採用Ficoll法從外周血中分離MNC，目標MNC的損耗率大於30%，且耗時近4小時。我們的自動化、全封閉系統X-LAB ?系統在30分鐘左右即可實現MNC回收率大於90%，同時去除紅細胞、粒細胞以及血小板。

文獻還指出，採用常規手工工藝或是第一代機械化工藝清洗已復甦白細胞產品導致T細胞損耗率高於30%。相反，自動化、全封閉系統X-WASH?能實現冷凍保護劑二甲亞碸（DMSO）去除率保持在99%以上，且T細胞損耗率低於10%，這比傳統磁珠分離法高出10%至15%的水平。

我們的試驗證明，在生產工藝下游的擴增環節，經微泡激活的細胞可保持活性,並且擴增效果優於傳統磁珠技術分選獲取的T細胞的擴增效果。與現有手工技術相比，我們自主研發的模塊式自動化技術每個工藝環節預計至少分別提升效率10-20%。

現階段我們的實驗數據基本都來自健康供體細胞，預計不久的將來我們就能取得真實患者提供的細胞，從而獲得最新的比較數據。提取患者大量細胞進行新技術測試的確頗具挑戰。這些重度患者最需要的是將活細胞盡多用於CAR-T治療，而非研究。然而，我們正在與凍存了「過量」患者細胞的機構合作，這些機構會不定期地因患者在細胞進行處理前不幸地去世，或因患者提供了超過所需的數量，而留下過剩的細胞。鑒於這些細胞來自重症患者且已凍存，接下來的幾個月內我們能夠用這些最真實的細胞對我們的技術進行測試，希望所獲數據與健康捐贈者細胞試驗數據一致。

Q：這個設備平台是否具有可擴展性？是否需要大量定製？

Coelho先生：CAR-TXpress?平台設備可擴展，無需大量定製。事實上，我們設計的每個模塊（X-LAB?, X-WASH? 或 X-BACS?），都只需要對其控制模塊進行編程。例如，如果需要純化MNC，僅需將控制模塊的程序根據原材料（即白細胞或外周血）稍作修改。一旦控制模塊進行了編程，CAR-TXPress?系統將持續重複這個程序。

為進行擴展測試，我們在當地一個GMP細胞處理實驗室做了一組對比試驗。將外周血分成兩份等量樣本，其中一份樣本交由熟練技術員採用Ficoll法及磁珠法來分離並激活T細胞；將另一份樣本交由熟練技術員使用X-LAB?和X-BACS?技術進行T細胞分離與激活，兩組技術員同時開始操作。結果，第一組技術員用Ficoll法剛完成MNC純化，採用CAR-TXpress?系統的技術員已經完成MNC純化、分選，並已激活CD3+細胞。

我們特地將CAR-TXpress?設計為模塊化系統，因為模塊化系統本身可以為企業有效控制成本，而非「瑞士軍刀」集成設備那般造價昂貴。採用模塊化平台，便於自主設計高效工藝流程。

此外，MNC純化、分選和激活環節如果能夠顯著減少T淋巴細胞的損耗，完成轉導後則可對已修飾T細胞進行簡單沖洗，將之輸注患者體內，使其在體內擴增。如果這種方法得到臨床驗證，則可大幅縮短從T細胞收集到臨床注射CAR-T細胞的時長。

Q：CAR-TXpress?系統不用Ficoll法或磁珠法分離和分選細胞，那麼它的基本原理是怎樣的呢？

Coelho先生：Ficoll密度梯度分離法常用於從外周血或白細胞中分離純化MNC，且已沿用40餘年，採用手工操作，耗時長且效率低。所有實驗技術員都用過這種方法。相信貴刊的很多讀者也都意識到這種方法的種種缺陷。對於需要CAR-T治療的患者而言，目標MNC在生產工藝的第一環節就損耗了30%至60%，其中約50%為T淋巴細胞，這些損失無法挽回，也不應讓急需CAR-T細胞治療的患者承擔。

磁珠法用於分離MNC中的T淋巴細胞，已沿用約25年，確實很有價值。然而，使用此方法規模化生產細胞以大面積供應患者群體時，其表現出來的低產能、低細胞回收率及低純度會帶來許多挑戰。此外，正如前面所說的，用於激活的一些磁珠產品本身就存在問題（磁珠的量通常比激活細胞的數量還要多），以至於FDA要求臨床醫生在細胞清洗前後對磁珠數量進行計數。

相反，我們設計的脂質殼微泡在細胞分選激活後便被釋放出來。轉導擴增後，殘餘物質經洗滌自動去除。

Q：能否請您描述BACS的工作原理，告訴我們它與其他細胞分離法有何不同之處？

Coelho先生：我們的浮力激活技術（BACS）利用脂質外殼、鏈酶親和素包裹氣泡，氣泡直徑2-3微米，與生物素化抗體結合來選擇、激活、或同時選擇激活靶細胞，如T淋巴細胞。

美國FDA非常了解微泡，並且批准在診斷造影技術中使用微泡。微泡可從任何部位直接輸入至患者血管，分散到全身，採用恰當的超聲信號能使微泡在體內爆破，從而傳播信號，呈現出附近組織的影像，使臨床診斷醫生可以無創地「觀察」該組織。

常規細胞分選技術利用塗有抗體的磁珠來附著表面帶有抗原的靶細胞，然後通過磁場環境來捕獲靶細胞。採用該技術，無論是靶細胞還是非靶細胞都向下流經具有磁場的狹窄通道。未附著磁珠的非靶細胞通過該通道時進入特定容器被清除。然而，靶細胞與非靶細胞的細胞混合物也會被磁場通道吸附，這也是該方法的局限性。因為捕獲的細胞群中存在著非靶細胞，從而降低了終產物中的靶細胞純度，且需要在轉導和T細胞擴增前增設工藝環節去除污染的單核細胞。

相反，CAR-TXpress?技術使用微泡/抗體複合物與靶細胞結合，改變了整體密度，離心分離時，非靶細胞下沉，靶細胞輕輕上浮，往非靶細胞相反的方向聚集（圖1）。

圖1：X-BACS?的工作原理

此外，我們的設備進行自動化處理所採用的特殊圓柱器皿帶有錐形處理倉（見圖1）。離心過程中，附著微泡的靶細胞緩緩上升至血漿上表層，T細胞回收率大於85%，單核細胞的去除率高於99%。

這非常重要，因為初步處理環節留下的T細胞無需再用昂貴耗時的工藝進行擴增。如果需要激活T細胞，可將CD3+和CD28+抗體同時與微泡結合（圖2），這也是X-BACS?技術的另一個重要特性。

圖2

我們認為，較傳統磁珠技術而言，X-BACS?細胞分選與激活技術具有顯著優勢。原因之一是脂質殼微泡幾個小時內會完全釋放，無需在操作前後進行微泡計數。

我們認為CAR-TXpress?是一項突破性技術，具有簡化生產工藝流程的潛力，我們期待與合作夥伴共同推進這一技術。

Q：如果治療公司將BACS技術納入其生產工藝流程，是否會存在監管障礙？

Coelho先生：每個國家都存在待解決的監管問題，但並非無法克服，最好的辦法是建立一個主文件（Master File）。例如，熱動力醫療持續更新有關X-LAB?、X-WASH?和X-BACS?系統的主文件，涵蓋了MNC純化、靶細胞分選與激活。這個主文件包含了FDA需要的所有相關信息，作為研究人員在臨床試驗新葯申請（IND）中應用這些系統的參考依據。X-BACS?試劑盒也載入主文件，存入與抗體、緩衝液和微泡相關的所有信息。

這些主文件也提供細胞製品中X-BACS?試劑殘留物的信息。微泡由親和性材料製成，這些材料在後續的處理過程中（轉導、洗滌、擴增、多次洗滌）會不斷減少。預計研究人員可在2019年初獲取這些主文件 。

Q：很多人認為材料供應商單一導致風險較高，您認為生產商應該採取哪些措施降低這些風險？

Coelho先生：首先需要明白，我們的產品可作為現有細胞處理環節的補充，對潛在客戶來說這無疑是件好事情。

況且，熱動力醫療擁有30多年臨床細胞處理設備開發經驗，所生產設備可重複使用數千次。因此，對於這些設備的需求，無需有採購數量的負擔。

更重要的是，與我們的電動設備配套使用的一次性處理套件和一次性試劑盒都能確保正常供應，因為我們正與大牌供應商簽署長期供貨協議。該供應商信譽卓著，會按我們的要求生產處理套件和試劑盒，並且制定了災難和風險緩解方案。

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