科學家用來篩葯的斑馬魚竟然只有米粒那麼大！這個「小精靈」有什麼厲害之處？
實驗室的96孔板通常是用來培養細胞的，來自美國華盛頓大學西雅圖分校的研究團隊竟然用來「養魚」——用96孔板來孵育斑馬魚（zebrafish）！一條新孵出的斑馬魚，比一粒米還小，從圖1所示，每個孔中的斑馬魚在歡快地游著。
圖1 96孔板的每個孔中是只有5天大小的斑馬魚。96孔板的孔徑約0.64 cm。這些小魚是治療聽力障礙的關鍵（它們體表的毛細胞是哺乳動物聽覺和內耳毛細胞的最佳模型）。圖片由華盛頓大學西雅圖分校的Edwin Rubel提供。
斑馬魚的體表（從頭部到尾部）都長有稱為神經丘（neuromasts）的毛細胞團。斑馬魚體表的毛細胞能夠發揮與人類耳蝸內的毛細胞類似的作用。斑馬魚的毛細胞是用來探測水中的振動，哺乳動物的毛細胞是聽覺的感受器，與內耳中耳蝸的神經相連。與人類不同的是，斑馬魚的毛細胞在受損後還可以再生，而人類的毛細胞不會再生，一旦足夠多的毛細胞死亡或突變，聽覺便開始衰退。斑馬魚的毛細胞對作用於哺乳動物內耳毛細胞的藥物同樣敏感。研究人員希望這些小小的斑馬魚和毛細胞可以用於治療一些藥物毒副作用帶來的耳聾。
2005年以來，華盛頓大學和弗雷德?哈欽森癌症研究中心的三個實驗室一直在利用斑馬魚分析並鑒定能夠保護聽覺細胞免受毒副作用的藥物，這些毒副作用來源於耳毒性的抗生素（氨基糖苷類抗生素）和腫瘤化療化合物。華盛頓大學神經發育遺傳學家David Raible對斑馬魚頗有研究，他發現了一種染料（dye），被活的神經丘吸收後，在熒光顯微鏡下觀察發現它們可以發光，而那些被抗生素殺死的毛細胞不發光。通過對每個神經丘中發光的毛細胞進行評析，研究人員可以快速鑒定生物活性化合物或表型改變的突變。
圖2 年齡只有5天的轉基因斑馬魚（brn3c:gfp）。綠色亮點是神經丘。右下角是神經丘的放大圖。Esterberg R, et al.(2013)
研究者們發現斑馬魚毛細胞對抗生素的濃度非常敏感。通過改變添加到孔中的抗生素的量，抗生素可以持續殺死每個神經丘中的全部，一些或僅幾個細胞。這種一致性表明斑馬魚實驗將足以作為表型藥物發現的工具。
2005年至2006年間，研究人員利用小分子化合物庫測試了11,000種化合物，並發現了一類非常有效的可以阻斷氨基糖苷類抗生素造成的耳毒性的分子——benzothiophene carboxamides（苯並噻吩甲醯胺），如PROTO-1和PROTO-2（Owens KN, et al. 2008）。然而，他們很快發現了一個問題，PROTO-1對人體有副作用，PROTO-1 抑制hERG鉀離子通道蛋白，其對心肌細胞的功能至關重要。另一個問題是PROTO-1的半衰期和溶解度低，不可能將它包裹成小藥丸存放。
研究人員又想到了斑馬魚，可以用它來測試PROTO-1的變體。最近，該研究小組利用斑馬魚對化合物進行了400多種化學修飾，欲將其優化為更有效的藥物（Chowdhury S, et al. 2018）。該研究團隊發現了一種更穩定的化合物，其抑制耳毒性效應的效力比PROTO-1強近百倍，對hERG途徑的抑制作用非常微弱。這種新化合物見圖3，FDA在今年早些時候批准它作為一種新的藥物。他們計劃在今年進行一期臨床試驗。另外，該團隊一直在利用斑馬魚揭示耳毒性藥物殺死神經丘毛細胞的基因和機制。
圖3 對篩選的藥物PROTO-1進行化學修飾
為什麼人們要用斑馬魚進行科學研究？
近十年來對斑馬魚的廣泛研究揭示了人類心血管、神經和其他生物過程中涉及的基因、細胞機制和藥物。斑馬魚是一個活的有機體，具有複雜的器官和生理系統。鹽湖城猶他大學化學生物學教授Randall Peterson是使用斑馬魚來篩選小分子的第一人，他說，利用斑馬魚可以用較少量的化合物進行大規模的篩選。魚可以直接從水中吸收化學物質，它們的透明度意味著不需要解剖。在哺乳動物中進行等效研究的成本肯定會更加高。
斑馬魚的神經丘在一小時內就可對施用藥物做出反應，而且允許研究人員可以有幾個月的時間完成篩查。雖然哺乳動物的內耳毛細胞用於聽覺，斑馬魚的神經丘純粹是為了感知周圍水中的波動。但在細胞水平上，神經丘毛細胞和哺乳動物內耳毛細胞的功能類似。兩種細胞類型都具有外部附屬物，這些附屬物對它們周圍的流體的運動作出響應，並且通過電信號將信息傳遞給大腦。從20世紀80年代後期開始的遺傳學篩選揭示了這兩種細胞類型之間高度保守的基因（Nicolson T, et al. 1998）。斑馬魚和人類基因有著87%的高度同源性，作為模式生物的優勢很突出。
神經科學家Edwin Rubel說，幾乎所有脊椎動物的毛細胞，除了哺乳動物，都很容易再生。沒有人知道為什麼哺乳動物失去了這種能力。但是如果沒有這種再生能力，老化、噪音損害和耳毒性化學物質都會導致永久性聽力喪失和耳聾。這些耳毒性化學物質其實也是救命藥物，如抗癌藥物順鉑或強效廣譜氨基糖苷類抗生素，醫生及患者必須平衡聽力損失風險與藥物有效性之間的關係。「目前，市場上沒有可靠的藥物來防止任何形式的聽力損失，」Rubel說。氨基糖苷類破壞細菌核糖體蛋白質合成，通過一種人們還不了解的機制靶向內耳細胞，而且具有個體差異。而最近利用斑馬魚發現的一種新化合物有望解決這個難題。
當利用斑馬魚進行表型篩選鑒定出具有豐富生物學特性的生物活性化合物時，是非常有益的。為了防止甚至逆轉聽力損失，需要確定關鍵的途徑和基因，而斑馬魚能為他們指出正確的方向。
文章來源：
1. Inner Workings: Zebrafish assay forges new approach to drug discovery.
Kim Smuga-Otto.
PNAS May 22, 2018.
2. Owens KN, et al. (2008) Identification of genetic and chemical modulators of zebrafish mechanosensory hair cell death. PLoS Genet 4:e1000020.
3. Chowdhury S, et al. (2018) Phenotypic optimization of urea-thiophene carboxamides to yield potent, well tolerated, and orally active protective agents against aminoglycoside-induced hearing loss. J Med Chem 61:84–97.
4. Nicolson T, et al. (1998) Genetic analysis of vertebrate sensory hair cell mechanosensation: The zebrafish circler mutants. Neuron 20:271–283.
5. Esterberg R, et al. (2013) Fish in a dish: Drug discovery for hearing habilitation. Drug Discov Today: Dis Models 10:e23–e29.
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