lncRNA研究思路分析及經典案例分享
近年來，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）相關研究的熱度一直居高不下。非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子，其中常見的具有調控作用的非編碼RNA包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、環形RNA（circular RNA，circRNA）等，這些RNA在細胞分化、生物發育及疾病發生髮展過程中都發揮重要的作用。
今天我們先來梳理一下lncRNA的相關知識和研究思路，大家快點準備好板凳，我們準備開講咯！
什麼是lncRNA? lncRNA有幾種類型？
lncRNA是長度大於200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA起初被認為是基因組轉錄的「噪音」，是RNA聚合酶II轉錄的副產物，不具有生物學功能。然而，此後越來越多的研究表明，lncRNA在眾多生命活動過程中發揮重要作用，並開始引起人們廣泛的關注。再加上二代測序技術的發展，大量 lncRNA 被發現，lncRNA迅速成為當今生命科學最熱門的研究領域之一。
根據染色體上與編碼基因的相對位置將lncRNA分為以下幾種類型：
反義型（antisense lncRNAs）
內含子型（intronic lncRNAs）
反向型（divergent lncRNAs）
基因間型（intergenic lncRNAs）
啟動子上游型（promoter upstream lncRNAs）
啟動子型（promoter-associated lncRNAs）
轉錄起始位點型（transcription start site-associated lncRNAs）
lncRNA的功能有哪些？
表觀遺傳修飾
表觀遺傳學修飾是指在核內DNA序列不變的情況下基因表達的可逆和可遺傳的變化， 這種修飾包括染色質重塑、DNA甲基化和組蛋白修飾。
轉錄調控
人類基因組中的啟動子和增強子在轉錄中起著不可或缺的作用，包括控制基因表達的時間和程度，同時確定它們的活性。 因此，轉錄機制非常複雜。
轉錄後調控
真核生物基因活性不僅可以通過轉錄方式進行調控，也可以通過RNA加工進行轉錄後調節，後一種調控機制是前體mRNA經歷選擇性剪接並作為競爭性內源RNA（ceRNA）。
其他機制
除了上述功能以外，lncRNA還可以與其他lncRNA關聯起作用，同時lncRNA中的功能基因多態性可能是與人類疾病有關的遺傳修飾。
lncRNA的作用模式有哪些？
lncRNA 的作用模式主要分為四大類: signal、decoy、guide、scaffold。
Signal archetype（信號原型）：作為轉錄活性的分子信號或指示劑；
Decoy archetype（誘餌原型）：與其他調控RNA或蛋白結合併隔離；
Guide archetype（指導原型）：指導核糖核蛋白複合物定位到特定目標；
Scaffold archetype（支架原型）：作為相關分子元件（蛋白和/或RNA）組裝的平台。
lncRNA常用資料庫有哪些？
lncRNA資料庫對於lncRNA的研究也很關鍵，為了便於大家快速查詢lncRNA序列等相關信息，下面羅列一些常用的lncRNA資料庫，供大家參考：
ChIPBase：提供lncRNA的表達圖譜和轉錄調控的全面鑒定和注釋。網站：http://deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/
LNCipedia：對人類lncRNA的序列和結構全面的注釋。網站：http://www.lncipedia.org
lncRNABase：提供miRNA調控lncRNA、假基因(pseudogene)和circRNA的互作信息和ceRNA調控網路。這些調控互作網路信息是基於高通量的CLIP-Seq實驗數據。網站：http://starbase.sysu.edu.cn/mirLncRNA.php
lncRNAdb：提供有生物學功能的lncRNA的全面注釋。這是lncRNA研究領域的大牛John mattick實驗室構建的網站。網站：http://www.lncrnadb.org/
LncRNADisease：提供了文獻報道的疾病相關的lncRNA的注釋。網站：http://cmbi.bjmu.edu.cn/lncrnadisease
NONCODE：提供對lncRNA的全面注釋，資料庫收錄多達16個物種信息，網站：http://www.noncode.org
等等。
檢測和驗證lncRNA方法有哪些？
lncRNA的研究離不開對lncRNA的檢測和驗證，以下方法是使用較多的手段：
高通量測序、lncRNA微陣列分析：是檢測lncRNA最常用的兩種方法，它們都能同時檢測到大量lncRNA的表達。
qRT-PCR、Northern 印跡：可用於驗證不同樣品之間的差異基因表達。
熒光原位雜交、RNAscope： 可用於檢測樣品中lncRNA的位置，後者顯示出更高的靈敏度和更高的特異性。
RACE ：有助於獲得全長lncRNA用於進一步研究。
RNA pulldown，RNA免疫沉澱（RIP）、CHIRP，發現與lncRNA相關的蛋白。
鑒於lncRNA研究有多種方法，需要根據具體的實驗情況選擇合適的實驗方法。
近幾年有關lncRNA研究的國自然立項數和經費逐年增長，2016年261項，經費為1.08億，2017年達到了345項，經費達到1.38億，從國自然本身就可以看出lncRNA一直是當前生命科學領域研究的熱點之一，同時針對lncRNA的研究也發表了大量的文獻。lncRNA研究中經典的ABCD模式——A基因通過B基因/信號通路在C疾病中發揮D功能，供大家參考。
下圖是常用的lncRNA研究思路：
案例分享：
接下來我們以中國醫科大學薛一雪教授作為通訊作者發表在《Cancer Letters》（IF=6.375）的Long non-coding RNA H19 regulates glioma angiogenisis and the biological behavior of glioma-associated endothelial cells by inhibiting microRNA-29a為例，講解一下lncRNA研究中典型的ABCD模式。
首先我們看一下這篇文章的題目：lncRNA-H19（A基因）通過抑制microRNA-29a（B基因）在膠質瘤相關內皮細胞（C疾病）中調節膠質瘤血管新生和生物學行為（D功能），完美符合ABCD模式。接下來開始分析這篇文章。
確定研究對象C疾病——膠質瘤
神經膠質瘤是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，並且具有侵襲血管形成的特徵。通過放療和化療治療的病人，其存活期僅12-14個月，治療效果差的一個主要原因是腫瘤的血管新生比較突出，因此抗血管生成在神經膠質瘤治療策略中將會越來越有前途。
確定研究A基因——lncRNA-H19
lncRNAs在神經膠質瘤的發生、發展中發揮重要的作用。之前的研究揭示了lncRNA-H19能調節腫瘤的癌變、血管新生和轉移，且在很多人類癌症中表達失調。研究發現H19不僅在高級別膠質瘤中高表達，而且對於維持膠質母細胞瘤幹細胞特性具有重要作用。
本文作者首先使用qRT-PCR方法檢測了H19在膠質瘤微管和膠質瘤相關內皮細胞的表達水平，結果發現H19在膠質瘤微管和膠質瘤相關內皮細胞中表達水平都是上調的，如圖1所示。
圖1
隨後作者在膠質瘤相關內皮細胞中做了H19的過表達和敲減實驗，以評估膠質瘤相關內皮細胞的增殖、遷移和血管形成對血管新生的潛在作用，其中增殖、遷移分別使用CCK-8、transwell進行檢測，實驗結果表明過表達H19實驗組的增殖、遷移和血管形成相比對照組都有一定提高，而敲減H19實驗組的增殖、遷移和血管形成相比對照組都有所下降。說明H19的表達水平能夠影響膠質瘤相關內皮細胞的表型。如圖2所示。
圖2
lncRNA-H19的分子機制——通過B基因發揮D功能
在了解了H19的功能後，作者隨後進一步驗證了H19的調節機制。之前的研究已明確lncRNA可以作為miRNA海綿來調節miRNA的表達及生物學功能，所以本篇文章也在驗證H19是否通過這個機制來發揮作用的。作者用生物信息學資料庫預測了H19的潛在作用位點。先用雙熒光素酶報告基因檢測驗證了H19和miR-29a的相互作用，再用過表達或敲低H19對miR-29a表達水平的影響進行驗證。結果發現，過表達H19能降低miR-29a表達，敲低H19能提高miR-29a表達，說明miR-29a是H19的一個作用位點。如圖3所示。
圖3
接下來作者驗證了miR-29a對膠質瘤相關內皮細胞表型的影響。結果發現，過表達miR-29a會抑制膠質瘤相關內皮細胞的增殖、遷移和血管形成，而敲低miR-29a會抑制膠質瘤相關內皮細胞的增殖、遷移和血管形成。如圖4所示。
圖4
隨後作者通過體外實驗驗證H19對膠質瘤相關內皮細胞的增殖、遷移和血管形成的影響是否與miR-29a有關。作者通過幾組對比實驗發現，H19（-）+miR-29a（+）組的細胞活力明顯降低，而H19（+）+miR-29a（-）組的細胞活力明顯提高。在H19（-）+miR-29a（-）組中，miR-29a對細胞活力的的抑制作用彌補了H19敲低引起的抑制效果。同樣，各組對遷移和血管形成的影響基本和對增殖的影響效果一致。如圖5所示。
圖5
作者確定了miR-29a和H19的相互作用後，還進一步研究了H19、miR-29a和其他基因是否在一個作用通路上。VASH2是已知的與腫瘤血管新生相關的重要基因，用Western blot實驗檢測了H19對VASH2表達效果的影響。結果發現，相對於對照組，VASH2蛋白表達在H19過表達組中是上調的，而在H19干擾組中是下調的。如圖6所示。
圖6
隨後作者用雙熒光素酶報告基因實驗驗證了VASH2是miR-29a的作用位點，同時為了確定VASH2是否受H19調節，作者檢測了miR-29a過表達和敲低後對VASH2表達的影響。結果顯示，miR-29a過表達後VASH2表達降低，miR-29a敲低後VASH2表達升高。如圖7所示。
圖7
之後作者通過實驗進一步揭示了在膠質瘤相關內皮細胞中miR-29a參與調節H19對VASH2的表達效果以及VASH2參與了miR-29a對增殖、遷移和血管形成的調節過程，得出通路H19-miR-29a-VASH2可以調節膠質瘤相關內皮細胞的表型。如圖8和圖9所示。
圖8
圖9
最後作者通過實驗分析了血管新生與H19和miR-29a表達水平之間的影響，發現H19敲低和miR-29a過表達都可以降低血紅蛋白量，從而抑制血管新生。如圖10所示。
圖10
結論：
本文是第一次揭示了H19在腫瘤組織的微管和膠質瘤相關內皮細胞中高表達。體外敲低H19可以上調miR-29a的表達，從而抑制膠質瘤相關內皮細胞的增殖、遷移和血管形成。基於這些發現，H19/miR-29a可以被認為是未來神經膠質瘤治療的潛在靶點。
本文小結：
lncRNA的表達或功能異常與人類疾病的發生密切相關，其中包括癌症、退行性神經疾病在內的多種嚴重危害人類健康的重大疾病，具體表現為lncRNA在序列和空間結構上的異常、表達水平的異常、與結合蛋白相互作用的異常等。因此，lncRNA研究對於生命科學領域至關重要，也將會作為遺傳學研究熱點持續下去。
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