號稱新一代CAR T的SUPRA CAR系統是如何設計的？

編者的話·寫在前面

CAR T是近年來研究較為深入的免疫療法之一，使其成為一種可調控、可編程的智能癌症治療手段是研究人員想要實現的目標。

為了更有效精確地調控CAR T細胞的免疫反應，研究人員開發了一種拆分的，通用的並且可編程的CAR T系統：SUPRA CAR。此系統相比於傳統的CAR T系統有更好的靈活性、可控性以及特異性，比如此SUPRA CAR系統不需要重新工程改造T細胞就能靶向新的抗原靶點，能夠對T細胞的激活反應進行微調，可以感知並且邏輯響應多種抗原信號。這些特點在對抗信號衰減，避免過度的T細胞激活反應，並且增強腫瘤識別特異性方面具有重要的意義和應用價值。

作者：陳澤華 孟凡康

校對：鄧婷月 孫智 張益豪

全文約5000字，閱讀時間約為15分鐘

儘管CAR T技術帶來的癌症治療效果有目共睹，但安全性和有效性仍然是CAR T療法面臨的重大障礙。為了提高CAR T細胞療法的安全性和有效性，我們急需在T細胞激活水平調節、靶向特異性、信號通路調控等方面優化CAR T系統。

目前的CAR T細胞具有以下幾點弊端：

1. 傳統的CAR T設計包含一個scFV（抗體單鏈可變結構）和細胞內信號結構域（CD3z和共刺激結構域）。但這種固定化設計使得我們每次都需要重新改造T細胞才能使其實現新的功能，同時這也使得我們難以控制CAR T細胞的免疫激活水平和T細胞相關的細胞毒性。

2. 除了限制了CAR T細胞的可控性，這種固定的CAR設計同樣限制了CAR T細胞的抗原特異性和親和性。CAR T設計中通常應用與抗原具有高親和力的scFV來保證其能高效地識別並結合腫瘤細胞的抗原。然而這些高親和力的抗體往往無法區分靶細胞抗原的密度，從而對能低水平表達相同抗原的健康細胞產生嚴重的免疫反應。而低親和力的scFV雖然可以更好的進行不同細胞抗體密度的區分，但是在識別抗原的特異性方面有所下降。因此，相比於改變scFV的的親和性，提高CAR T細胞特異性上更好的策略可能是對CAR組成進行模塊化設計。

3. 有研究表明獨立調控第一信號區域和共刺激區域可以優化T細胞反應，此外，將共刺激區域分開激活可以讓T細胞展現不同的功能和表型（如T細胞分化、記憶T細胞形成）。因此設計CAR T系統使其可以獨立控制不同的信號通路具有重要的價值。這一點也是傳統CAR T系統不具備的。

4.T細胞亞群的組成（比如CD4+和CD8+T細胞的比例）在增強CAR T細胞抗腫瘤反應中是非常重要的參數。考慮到我們的免疫系統含有多種不同效應功能的T細胞亞型，獨立調控不同類型的T細胞很可能是優化CAR T細胞療法的另一種策略。傳統CAR T的固定化設計無法實現對不同信號結構域或者不同T細胞亞型的獨立的、可誘導的激活，無法針對不同的患者實現多種T細胞免疫響應。

為了增加CAR T療法的安全性和有效性，目前已經有一些設計的CAR T系統被用來提高它的可控性、靈活性、特異性。比如設計藥物誘導型的ON/KILL開關來調控CAR T活性；將胞外抗原識別模塊和胞內信號模塊分開來增強其靈活性；使T細胞同時表達兩個不同的嵌合抗原受體增加對腫瘤識別的特異性。但是，這些設計並沒有任何一個能夠同時解決上面所說的傳統CAR T的4種問題。

2018年4月26日，《Cell》在線發表題為Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses的文章，SUPRA CAR系統橫空出世。之後SUPRA CAR被多家科技媒體評為新一代的CAR T免疫療法，引起了廣泛的關注。

總體來說，SUPRA CAR系統具有以下特點：

△SUPRA CAR系統是拆分的、通用的、可編程的；

△SUPRA CAR系統能夠對T細胞激活反應的強度進行調節從而減輕副作用；

△SUPRA CAR系統能夠感知並且邏輯響應多種抗原信號；

△SUPRA CAR系統能夠調控不同免疫細胞類型的信號通路；

那麼SUPRA CAR系統是如何設計的呢？接下來我們將會進行詳細的解讀。

01

SUPRA CAR系統的設計和特徵參數

SUPRA CAR系統由兩部分組成：在T細胞內穩定表達的通用受體（zipCAR）以及識別腫瘤抗原的scFV配體（zipFV）。zipCAR通用受體融合了胞內信號區域和亮氨酸拉鏈，zipFV配體融合了亮氨酸拉鏈和scFV。（亮氨酸拉鏈的結構是由2-5個a螺旋扭曲成的超螺旋結構。當來自同一個或不同多肽鏈的兩個兩用性的α-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸殘基）相互作用形成一個圈對圈的二聚體結構時就形成了亮氨酸拉鏈）zipFV的scFV識別並結合腫瘤抗原，亮氨酸拉鏈結合併激活T細胞的zipCAR。

圖1：SUPRA CAR系統的簡要介紹。

不同於固定的CAR T設計，SUPRA CAR系統能在不用重新改造人體T細胞的前提下靶向多種抗原。研究人員在CD8+ T細胞中表達了RR zipCAR，同時設計了三個不同的zipFV分別靶向三種常見的腫瘤抗原（a-Her2, a-Axl,a-Mesothelin）。結果證明當加入對應的zipFV時，CD8+zipCAR T細胞能成功殺死腫瘤細胞。

圖2：SUPRA CAR系統能在不用重新改造人體T細胞的前提下靶向多種抗原

SUPRA CAR系統的可調參數具有以下幾個方面：

（1）亮氨酸拉鏈間的親和性。通過設計三個對RR zipCAR有不同程度親和性的zipFV（scFV相同，但亮氨酸拉鏈不同：a-Her2-EE/SYN5/SYN3）來觀察T細胞的激活水平，實驗結果表明亮氨酸鏈間的親和性越強，EC50（T細胞分泌細胞因子達到1/2最大值所需要的zipFV劑量）越低，細胞因子分泌的越多，T細胞毒性越強。

（2）腫瘤抗原和scFV之間的親和性。通過對12個不同zipFV（3個不同的亮氨酸拉鏈和4個對Her2有不同結合常數的scFV進行任意組合）進行測試發現腫瘤抗原和scFV之間的親和性對T細胞的激活貢獻不大，而亮氨酸拉鏈的親和性能顯著提高T細胞的激活水平。

（3）zipFV的濃度。zipFV濃度越高，細胞因子分泌越多，到達閾值時細胞因子的分泌量穩定在最高水平

（4）zipCAR的表達水平。zipCAR表達水平高的細胞在被激活時能分泌更多的細胞因子。

綜上所訴，為了解決臨床中出現的因CRA T細胞過度激活而產生的細胞毒性，SUPRA CAR系統能通過調節多個參數來調控T細胞的激活水平。

圖3：SUPRA CAR系統的可調參數

02

引入競爭性機制來調節SUPRA CAR系統活性

因為很多接受CAR T細胞療法的患者都面臨著因細胞因子釋放綜合症而威脅到生命的問題，所以需要在必要的時候阻斷T細胞的活性。在這項工作中研究人員選擇加入競爭性的zipFV來抑制SUPRA CAR T細胞的激活水平。通過加入對EE zipFV有不同親和性的競爭性zipFVs，研究人員成功地降低了SUPRA CAR T細胞的激活水平，降低了細胞因子的釋放。

利用競爭性機制，研究人員發現通過加入對EE zipFV有強親和性的SYN4 zipFV來抑制體外CD8+ T的激活，通過加入對EE zipFV有較弱親和性的SYN47 zipFV和SYN13 zipFV可以調節體外CD8+ T的激活水平。

圖4：SUPRA CAR系統引入競爭性機制來調節T細胞激活反應強度

03

SUPRA CAR系統可以實現邏輯調控

為了解決抗原逃逸，CAR T細胞療法有時候會使用雙抗原識別受體來靶向腫瘤細胞。但是腫瘤細胞的高突變性使其仍然能夠捨棄能被識別的抗原從而實現免疫逃逸。

如果利用傳統的CAR T系統，T細胞需要被重新改造，而通過SUPRA CAR平台，我們能夠在不需要進一步進行基因改造的前提下靶向多種腫瘤抗原。實驗證明，不論是加入識別一種抗原的zipFV（a-Her2或者a-Axl,）,還是同時加入識別兩種不同抗原的zipFV（a-Her2和a-Axl,）,SUPRA CAR系統都能夠很好地發揮作用，這表明SUPRA CAR系統具有阻止腫瘤抗原逃逸的巨大潛力。

圖5：SUPRA CAR系統實現「OR」邏輯門

腫瘤免疫療法的另一限制因素是其很難識別單個的腫瘤特異性抗原，而SUPRA CAR系統可以達到「細胞篩選器」的功能，只能特異性地殺死單獨表達Her2抗原的目標細胞，而過濾掉表達Her2和Axl兩個抗原的細胞。

為了實現這個目標，研究人員設計了「非與」的邏輯門：當細胞表面有兩個抗原（Her2和Axl）時，抗原抗體的結合使a-Axl-SYN2zipFv 和a-Her2-EE zipFv距離拉近，互補的亮氨酸拉鏈結合從而阻斷了T細胞的激活，抑制了細胞因子的釋放；當細胞表面只表達一個抗原（Her2）時，a-Axl-SYN2 zipFv不能結合在細胞表面，a-Her2-EE zipFv能成功結合zipCAR並激活T細胞大量產生強烈的細胞毒性。

圖6：SUPRA CAR系統實現「細胞篩選器」—Cell Selector的功能

04

SUPRA CAR系統體內腫瘤清除的效果

研究人員在免疫缺陷型小鼠體內分別移植了SK-BR-3 乳腺癌症細胞(Her2+)以及改造過的Jurkat T血液腫瘤細胞（Her2+），培養一段時間後注射能表達RR zip CAR的CD8+T細胞（或者加入傳統的Her2 CAR），隨後每隔1-2天注射a-Her2-EE zipFv，數據和照片結果顯示相比於不注入任何T細胞和只注入表達RR zip CAR的CD8+T細胞的對照組而言，SUPRA CAR系統能夠很好的殺死並清除腫瘤細胞，作用效果相比於傳統CAR T細胞並沒有降低。

圖7：SUPRA CAR系統體內清除癌症細胞的效果

除此之外，為了盡量降低可能存在對於合成的亮氨酸的免疫排斥，研究人員融合了來自人體的FOS和JUN轉錄因子的拉鏈區域，組成新的FOS zipCAR和JUN zipFV，實驗結果證明無論在體內還是體外，這個來自人體內的SUPRA CAR系統的效率都和合成的一樣好。

圖8：人源FOS zipCAR和JUN zipFV的效果與合成的zipCAR效果對比

05

調控參數控制SUPRA CAR系統在體內的活性

如何控制體內CAR T細胞表達的細胞因子水平對於防止細胞因子釋放綜合症具有重要意義。研究人員利用三個策略控制體內細胞因子的表達：

（1）控制zipFV的注射劑量。結果表明，zipFV的注射劑量大於2mg/kg可以更好更快地清除腫瘤細胞。雖然zipFV的注射劑量在0.5mg/kg和 2mg/kg之間以及在4mg/kg和8mg/kg之間時對腫瘤清除效果相差不大，但zipFV的注射劑量越大，細胞因子分泌的越多。

（2）改變亮氨酸拉鏈的親和性。正如體外結果所展示的，體內細胞因子的表達量與亮氨酸拉鏈的親和性呈正相關。亮氨酸拉鏈的親和性越強，體內細胞因子分泌越多。

（3）引入競爭性zipFV來抑制SUPRA CAR從而減少細胞因子的分泌。加入具有較強競爭性的zipFV時，細胞因子的分泌量顯下降；當加入沒有競爭作用的對照zipFV時，體內細胞因子的釋放不受影響。這些體內細胞因子表達量的結果表明SUPRACAR系統可以通過多種途徑調節細胞因子的釋放，從而減輕細胞因子釋放綜合症以及其他由於傳統CAR T細胞療法而引起的毒性。

圖9：SUPRA CAR系統可以通過三種策略控制體內細胞因子的表達水平

06

利用正交的SUPRA CAR實現對不同信號區域的獨立控制

SUPRA CAR系統的一個關鍵屬性在於多種正交的SUPRA CAR系統可以在一個細胞中調控多個信號通路，實現T細胞信號傳遞和響應的高度自定義化調節。研究人員設計了兩個正交的SUPRA CAR來獨立調控不同的信號通路：FOS zipCAR（結合a-Her2-SYN9 zipFv）只包含CD3Z區域，RR zipCAR(結合a-Axl-EE zipFv)包含共刺激信號區域CD28和4-1BB。通過對比在a-Axl-EEzipFv和a-Her2-SYN9 zipFv的濃度下CD69的表達量以及細胞因子的釋放量，研究人員驗證了SUPRA CAR系統的正交性可以幫助我們實現對於不同信號區域的獨立控制。

圖10：SUPRA CAR系統可以實現對不同信號區域的獨立控制

07

正交的SUPRA CAR實現對不同類型T細胞的控制

不同的T細胞亞型能夠實現不同的功能，CD4+T細胞能幫助T細胞分泌細胞因子，調控免疫反應，CD8+ T細胞則能夠直接殺死癌症細胞。獨立控制兩種細胞來促進不同的T細胞反應可以進一步地增強CAR T細胞療法的效果。為了驗證SUPRA CAR系統的正交性能否在不同T細胞中實現，研究人員設計CD4+T細胞表達RR zipCAR（結合a-Axl-EE zipFv），而CD8+T細胞表達FOS zipCAR（結合a-Her2-SYN9 zipFv）。結果證明SUPRA CAR系統可以實現對不同T細胞的獨立控制，同時，CD4+T和CD8+T細胞的同時激活大大提升了細胞因子的表達量。

圖11：正交的SUPRA CAR可以實現對不同類型T細胞的控制

再創丨Regenesis 編輯部點評

SUPRA CAR系統具有調整T細胞的激活水平，增強對腫瘤的特異性，可獨立控制不同的信號通路和細胞類型等能力。其充分利用了合成生物學中「模塊化」的概念，將傳統的CAR T系統拆分為胞內信號模塊，亮氨酸拉鏈模塊以及胞外抗原抗體識別模塊，使我們能在多個層次和多重邏輯上對T細胞的激活水平做出調整，極大地提高了CAR T系統的可控性，靈活性以及特異性，打破了傳統CAR T系統存在的諸多限制和壁壘。

參考文獻：

Cho, Jang Hwan, James J. Collins, and Wilson W. Wong. "Universal Chimeric Antigen Receptors for Multiplexed and Logical Control of T Cell Responses."Cell(2018).

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