非小細胞肺癌EGFR突變靶向治療3

第4章EGFR-TKI耐葯機制研究

一、EGFR耐葯與基因

在每一個正常細胞基因組裡都帶有原癌基因，但它不表現致癌活性，只是在發生突變或被異常激活後才變成具有致癌能力的癌基因。抑癌基因是一類存在於正常細胞中的、與原癌基因共同調控細胞生長和分化的基因也稱為抗癌基因。

癌基因的激活：①點突變：在基因的編碼順序上某一個核苷酸發生的突變稱為點突變；②基因重排：原癌基因中某一部分從一個位置移到另一位置可改變原癌基因的結構；③基因擴增：某些原癌基因複製時可以由一個拷貝轉變為多個拷貝。在一個癌瘤細胞中，一般不止存在一種原癌基因的激活。多個原癌基因在腫瘤發生的多個階段上，相繼或同時被激活。同時，正常細胞中存在抑癌基因，在被激活情況下它們具有抑制細胞增殖的作用，正常情況下它們對細胞的發育、生長和分化的調節起著重要作用，這些基因由於甲基化、突變等各種原因導致基因失活，或當其產物失去活性時，可導致腫瘤的發生和癌變。

雖然靶向治療顯著改善了NSCLC患者的生存，但絕大部分患者在一年內不可避免地出現耐葯。耐葯嚴重製約著靶向治療的進展，影響患者長期生存。原發耐葯指藥物一開始就無效。獲得性耐葯就是原來敏感的藥物逐漸失去了敏感性。而把不敏感的藥物變得重新敏感稱為逆轉耐葯。特別是單葯治療的患者，更快會出現耐葯。

圖4.1EGFR-TKI耐葯機製圖（Yuxin Lin, et al. Am J Cancer Res. 2014;4(5): 411–435.）。

傳統化療耐葯的把藥物泵出細胞外的理論不適合靶向治療。因為靶向藥物如西妥昔單抗只要與癌細胞膜上EGFR蛋白一接觸就會發生作用，並不需要進入細胞內，就不存在泵出一事。靶向藥物耐葯的機制應該涉及跨膜受體和信號通路。由於信號通路的複雜性和研究的局限性，全面掌握靶向藥物的耐葯機制目前不現實的。當前EGFR抑製劑耐葯機制的研究主要集中於驅動基因改變和信號網路的改變。

二、第三代EGFR抑製劑耐葯相關機制研究

1、EGFR成癮突變

近幾年研究證明，T790M突變占吉非替尼耐葯突變的近一半，成為吉非替尼最主要的獲得性耐葯機制。而T790M突變獲得性耐葯後是C797S。變來變去都是EGFR突變，稱之為EGFR成癮突變或嗜EGFR突變。第一代可逆EGFR小分子口服抑製劑（TKI）主要是吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼。第二代不可逆EGFR抑製劑包括阿法替尼、達克替尼，第二代EGFR抑製劑地位最尷尬。第一代抑製劑耐葯患者，阿法替尼也可能跟著耐葯。患者一開始使用第一代抑製劑，耐葯後一般使用第三代抑製劑。這樣的話，如果患者一線靶向治療使用二代抑製劑是否優於一代抑製劑？答案是肯定的。

2、第三代EGFR抑製劑奧希替尼療效比較

Liu Y等分析治療前原發和治療後獲得性EGFR T790M突變晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者對接受第三代酪氨酸激酶抑製劑(TKIs)療效的影響。分析包括22個研究1462例非小細胞肺癌存在激活EGFR突變和接受EGFR-TKIs治療。相比於治療前無T790M突變NSCLC，治療前T790M陽性突變NSCLC患者無進展PFS和總生存時間OS更低，以及更差的總應答率ORR趨勢。與沒有T790M突變EGFR-TKI治療後進展相比，獲得性T790M突變與PFS的改善相關。獲得性T790M突變陽性和T790M突變陰性非小細胞肺癌患者OS或ORR沒有明顯差別。不過，在腫瘤組織活檢亞群,與T790M突變陰性患者相比，獲得性T790M突變患者改善了OS。在血漿ctDNA亞群，獲得性T790M突變OS更差。由此得出結論，治療前T790M突變晚期NSCLC患者EGFR-TKIs治療與更差的PFS和OS相關，而獲得性T790M突變比T790M突變陰性非小細胞肺癌具有更長的PFS和OS。腫瘤組織活檢獲得性T790M突變與血漿ctDNA檢測之間OS也不同。

3、第三代EGFR抑製劑耐葯突變C797S研究

Thress KS等分析15個AZD9291治療患者，這些患者在治療前都是T790M陽性突變，一旦AZD9291耐葯，6個獲得C797S突變，5個維持T790M突變但沒有C797S突變，4個T790M突變缺失但還是EGFR突變佔優勢。說明了AZD9291耐葯異質性。

Avizienyte E等研究第一代EGFR抑製劑的耐葯，包括厄洛替尼、拉帕替尼和CI-1033。Gly(796)或Cys(797)導致CI-1033快速耐葯。T790M突變對所有抑製劑很常見，只不過突變的頻率不同而已。而存在C797S和T790M在同一EGFR等位基因引起厄洛替尼、拉帕替尼和CI-1033完全耐葯。

Ercan D等指出EGFR L718Q，L844V，C797S導致WZ4002和CO-1686耐葯，只有EGFR C797S導致AZD9291耐葯。19 Del或L858R與L718Q，L844V，或C797S並存還能保持吉非替尼和阿法替尼的敏感性（本人理解為T790M陽性變為陰性）。C797S突變並存19Del或L858R且T790M突變對目前所有EGFR-TKI耐葯，但L858R/T790M/C797S（順式突變）保留對西妥昔單抗的部分敏感性。

關於C797S突變最引人注意的文章是，Matthew J. Niederst等對AZD9291耐葯後C797S與T790M在等位基因的位置關係得出不同的臨床結果。研究以EGFR 19突變為對象（圖4.3），①在一代或二代或三代一線治療耐葯後，在EGFR突變僅與C797S突變在同一等位基因上，且T790M沒有突變，可以在三代EGFR抑製劑耐葯後繼續使用一代EGFR抑製劑有效。②當外顯子19突變並同時T790M突變情況下，使用三代EGFR抑製劑耐葯後存在2種狀況：T790M與C797S突變不在同一等位基因，可以使用第一代+第三代EGFR抑製劑治療（稱為反式）；而T790M突變及C797S突變在同一等位基因上目前沒有有效治療辦法（稱為順式）。

圖4.3：AZD9291 C797S突變不同的臨床結果（Matthew J. Niederst,et al. Oncotarget. 2016 Dec 27;7(52):86313-86325.）

4、AZD9291其他耐葯機制和逆轉

Tang ZH等指出奧西替尼（AZD9291)批准用於NSCLC EGFR/T790M突變治療，效果顯著，但耐葯也是不可避免的。通過比較研究奧西替尼耐葯NCI-H1975的細胞系NCI-H1975/OSIR和未耐葯NCI-H1975細胞系。與未耐葯的NCI-H1975相比，耐葯NCI-H1975/OSIR細胞系對吉非替尼，厄洛替尼，阿法替尼，CO-1686，多柔比星，氟尿嘧啶更加耐葯，而顯示對紫杉醇的更高敏感度。此外，NCI-H1975/OSIR細胞並不顯示多葯耐葯。耐葯後EGFR的活性和表達降低，NCI-H1975/OSIR誘導的ERK和AKT激活不能被奧西替尼明顯抑制。而Navitoclax (ABT-263，Bcl-2抑製劑)誘導NCI-H1975/OSIR細胞活性抑制和凋亡。EGFR的缺失可能是奧西替尼耐葯的一個特徵，navitoclax可能成為奧西替尼耐葯的候選治療藥物。

Ichihara E等指出AZD9291敏感的腫瘤細胞持續AZD9291治療，會導致Src家族激酶（Src family kinases，SFK)和黏附激酶（focal adhesion kinase，FAK)激活，以及激活AKT和MAPK信號通路。或抑制MAPK或抑制AKT會加強AZD9291的療效。而AZD9291聯合SFK/FAK抑製劑產生最佳療效，包括生長抑制，誘導凋亡，延緩獲得性耐葯。在AZD9291耐葯的EGFR突變的腫瘤細胞，SFK家族成員YES1存在擴增，是AZD9291獲得性耐葯的原因，但被AZD9291聯合SFK抑製劑所抑制。而且AZD9291聯合達沙替尼療效遠比AZD9291聯合MAPK抑製劑或AKT抑製劑好。結論是AZD9291聯合SFK/FAK是EGFR突變的NSCLC治療的一種潛在治療方法。（本文最大的意義在於9291聯合達沙替尼優於9291聯合MAPK/AKT抑製劑）

Eberlein CA等體外比較AZD9291耐葯的細胞與未耐葯細胞，發現耐葯細胞對MEK抑製劑司美替尼(AZD6244; ARRY-142886)更敏感。體內聯合AZD9291和司美替尼阻止PC9細胞系出現耐葯和延緩NCI-H1975細胞系耐葯。在EGFR突變/T790M突變轉基因模型聯合AZD929和司美替尼引起AZD9291耐葯腫瘤的退化。Cath Eberlein等指出ERK突變是導致9291耐葯的原因。T790M突變誘導ERK突變，司美替尼是MEK抑製劑，位於ERK信號上游，形成MEK/ERK通路。抑制MEK阻斷腫瘤信號旁通EGFR。

Ou SI, Agarwal N, Ali SM等報道一位患者AZD9291治療部分有效，使用9個月後獲得性耐葯。AZD9291治療前後的活檢顯示耐葯後出現高水平的MET擴增達30倍。患者使用克唑替尼出現短暫獲益。應當考慮MET也是AZD9291耐葯的一種機制。

Uchibori K等表示C797S突變削弱了EGFR和osimertinib在797位置共價半胱氨酸殘基之間的結合，誘發osimertinib耐葯。目前，沒有有效的治療策略來克服C797S/T790M/EGFR激活突變(EGFR三突變)介導EGFR-TKI耐葯。通過研究確定brigatinib（AP26113）在體外和體內對EGFR三突變是有治療效果。最初的計算模擬表明brigatinib符合三突變EGFR的磷酸腺苷ATP的結合位。結構活性關係分析揭示了brigatinib關鍵組分抑制EGFR三突變。通過與抗EGFR抗體聯合，brigatinib抑制效果顯著增強，是因為減少的細胞表面和總EGFR表達。因此,聯合治療Brigatinib聯合EGFR抗體是一種克服EGFR三突變強有力的治療辦法。

Martin MJ等表明代謝重塑是癌症一個基本特徵，在轉化細胞中經常看到糖酵解增加。小分子抑製劑在靶向癌驅動基因時也會抑製糖酵解。但奧西替尼抑制未耐葯EGFR細胞的糖酵解而不能抑制耐葯細胞的糖酵解。關鍵問題是奧西替尼治療誘導了嚴格依賴於線粒體的氧化磷酸化過程（OxPhos），OxPhos抑製劑明顯延遲奧西替尼獲得性耐葯細胞的進展。同樣的是，生長條件更少依賴糖酵解在一定程度上更易耐葯。所以支持奧西替尼和OxPhos抑製劑聯合治療奧西替尼未耐葯的EGFR突變。（文中OxPhos是糖尿病藥物苯乙雙胍）。

圖4.4奧西替尼聯合氧化磷酸化抑製劑協同機制（Martin MJ,et al.Oncotarget.2016 Dec 27; 7(52): 86313–86325.）。

Uchibori K等在一個NSCLC患者的腦轉移病灶中，發現了EGFR T790M突變，在奧西替尼進行長期治療後，檢測出MET基因擴增。重要的是，聯合卡馬替尼(C-METt抑製劑)和阿法替尼(ERBB-1/2/4抑製劑)完全抑制了原位移植小鼠大腦的腫瘤生長。

Della Corte CM等在老鼠模型研究奧西替尼耐葯後的治療策略。發現司美替尼或西妥昔單抗+奧西替尼逆轉奧西替尼敏感性，應答率(RR) 50-80%，中位無進展生存PFS (mPFS)在敏感時期和耐葯後聯合治療共為28周。在所有聯合治療模型，相比於奧西替尼單葯，敏感期更早使用聯合治療增加應答率達90%，中位無進展生存PFS沒有達到（統計時還生存），統計學優勢顯著，敏感期中位無進展生存PFS達到17-18周。從體外培養獲取奧西替尼耐葯腫瘤，發現hedgehog信號通路激活，需要增加Smo抑製劑。

5、AZD9291耐葯的異質性

有研究報道一個病例，一個4期60歲女性患者EGFR突變使用厄洛替尼治療後耐葯，檢測出現T790M突變，服用AZD9291後耐葯檢測出C797S突變。並且EGFR、T790M和C797S並存。

又有報道2個AZD9291耐葯的樣本活檢發現其中一個存在HER2和MET擴增並伴隨T790M的缺失，另一個原發部位保留T790M突變，而轉移部位T790M陰性。AZD9291耐葯可能是T790M突變的細胞被殺死，而T790M野生細胞發展而導致耐葯。

Kim TM等通過比較性研究探討AZD9291耐葯的機制。4位AZD9291耐葯的患者在9291耐葯前後的基因比較的結果如下：3人耐葯進展而AZD9291耐葯的腫瘤細胞減少到1%(基準14%-36%)以下，其中一個EGFR的2次突變丟失（EGFR-/ T790M-），一個變為小細胞肺癌，一個成纖維生長因子FGFR1擴增，第4個耐葯後進展EGFR突變保留而配體EGF擴增。

三、阿法替尼耐葯機制研究

第二代EGFR抑製劑阿法替尼是一個具有高度選擇性，不可逆轉的表皮生長因子受體EGFR和HER2抑製劑。抑制HER1（EGFR）、HER2和HER4，也抑制T790M突變。

圖4.5阿法替尼作用靶點示意圖（Valerie Nelson,et al.Onco Targets Ther. 2013; 6: 135–143）。

Yamaoka T等研究阿法替尼不同的耐葯機制，通過EGFR突變肺腺癌PC9細胞長期暴露於不斷增加劑量的阿法替尼，發現了阿法替尼不同的獲得性耐葯機制。值得注意的是,三個阿法替尼耐葯細胞株：PC-9AFR1、PC-9AFR2和PC-9AFR3(分別簡稱AFR1、AFR2和AFR3)，它們採用不同的機制逃避EGFR抑製劑的抑制，而且在以上所有耐葯細胞系還存在EGFR表達增加情況。此外，在AFR1和AFR2細胞活化的EGFR部分丟失。AFR1細胞出現阿法替尼耐葯是由於野生型KRAS擴增和過表達；然而，這些細胞表現出逐步減少並最終失去了對KRAS的依賴，以及過一段空窗期後重新恢復阿法替尼的敏感性。同時，AFR2細胞表現出增加胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)的表達，促進了胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)活化，隨後AKT磷酸化，表明存在與IGFR1信號相關的旁通路徑。而AFR3細胞擁有繼發EGFR T790M突變。

Wu SG等研究來自阿法替尼耐葯的42個患者組織標本，EGFR突變的敏感度在阿法替尼治療前後是一致的。20例(47.6%)獲得了T790M突變，T790M突變率與沒有使用第一代EGFR抑製劑治療病人突變率(50%)和使用第一代EGFR抑製劑治療的患者突變率(46.4%)(p = 0.827)沒有差別。在T790M獲得性進展後沒有臨床特點或其他EGFR突變類型。未發現EGFR位點另外突變。沒有小細胞或鱗狀細胞肺癌轉換。沒有發現其他基因突變，如PIK3CA,，BRAF，HER2，KRAS，NRAS，MEK1，AKT2，LKB1，JAK2。肺腺癌阿法替尼耐葯後檢測出近一半的T790M突變。T790M仍然是主要的獲得性耐葯機制。第一代EGFR TKI治療沒有影響阿法替尼獲得性耐葯後T790M的突變率。

Lee Y等研究阿法替尼耐葯機制，利用人NSCLC細胞系H1975阿法替尼耐葯模型，模型存在EGFR T790M和EGFR L858R突變。發現激活的胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)信號通路導致存在T790M突變NSCLC細胞阿法替尼耐葯。IGF1R敲除不僅恢復耐葯細胞對阿法替尼敏感,而且也誘導阿法替尼耐葯細胞凋亡。此外,結合阿法替尼和linsitinib（IGF1R抑製劑）對H1975異種移植體內腫瘤生長抑制影響遠大於1+1=2。表明抑制IGF1R或聯合EGFR-IGF1R抑制策略將是可能預防或加強當前顯示耐葯的第一或第二代EGFR抑製劑的治療效果。

van Hoppe S等調查阿法替尼耐葯與多葯外排轉運蛋白ABCB1和ABCG2的關係，使用體外模型研究ABCB1，ABCG2阿法替尼轉運機制。發現ABCG2和ABCB1a/1b限制阿法替尼口服利用性和大腦阿法替尼積累。抑制這些轉運蛋白對腦轉移患者非常重要。

四、第一代EGFR抑製劑耐葯機制研究（非EGFR成癮機制）

NSCLC腫瘤的異質性必然導致EGFR抑製劑壓力下腫瘤不同的逃逸方法，除EGFR成癮性突變外，其他的逃避機制很多，應該說第一、二和第三代存在相同的異質性逃避即耐葯機制。分開說明主要是考慮不同抑製劑。

1、HGF/MET驅動

MET基因又稱為HGFR，即肝細胞生長因子受體。它與其配體肝細胞生長因子一起都是癌症生成的重要因素。

圖4.6 HGF/CMET信號通路圖（Rachel N. Frisch,et al.ExpertOpin Ther Targets. Author manuscript; available in PMC 2017 Sep 1.）。

Mizuuchi H等使用HCC827EPR外顯子19突變和T790M突變腫瘤細胞緩慢暴露於CNX-2006 (rociletinib-1686)而建立耐葯的細胞亞群。通過對這些亞群的分析，發現存在MET的2種耐葯機制。一是除T790M外由MET擴增導致的信號旁通，被CNX-2006和MET抑製劑聯合抑制。另一是擴增的EGFR突變等位基因包括T790M丟失而獲得MET擴增，有趣的是MET抑製劑單葯就能夠克服耐葯，提示致癌基因對EGFR的依賴完全轉移到MET。描述這種現象為致癌基因轉換。而且，分析取自於一個死於吉非替尼耐葯的患者的多個組織，也發現這種現象，EGFR突變丟失而MET獲得。總之，致癌基因轉換，從EGFR到MET是個新的EGFR抑製劑耐葯機制。（這篇文章帶來的思考是是否MET擴增是EGFR耐葯唯一的驅動基因？）

Nanjo S等研究EGFR突變，包括T790M突變的柔腦膜轉移EGFR抑製劑耐葯機制。在32個EGFR突變的肺癌患者EGFR抑製劑治療後複發，進行重新活檢，活檢的樣本中，12個來自柔腦膜轉移，20個顱外組織。所有32個樣本耐葯前有同樣的EGFR突變類型，但T790M突變在柔腦膜轉移的樣本中出現比顱外樣本少得多(8% vs. 55%)。在PC-9吉非替尼耐葯模型，T790M突變在柔腦膜確實發生概率比較低，而且很快對吉非替尼和奧希替尼耐葯。這與MET激活的MET副本數獲得有關，使用EGFR抑製劑聯合克唑替尼戲劇性地使吉非替尼和奧希替尼耐葯的柔腦膜轉移灶退化。說明了EGFR抑製劑聯合MET抑製劑是一種有前途的控制柔腦膜轉移的治療措施。

Nakagawa T等使用EGFR抑製劑WZ4002和MET抑製劑E7050對3個厄洛替尼耐葯EGFR突變肺癌細胞系進行耐葯機制研究。PC-9/HGF細胞系存在外顯子19缺失突變，H1975存在L858R突變，HCC827ER存在外顯子19缺失突變，並對厄洛替尼耐葯。這三個細胞系分別並存HGF基因激活，T790M突變和Met擴增。WZ4002抑制H1975細胞系T790M突變的生長，但不能抑制HCC827ER和PC-9/HGF細胞系生長。因為HGF激活H1975細胞系對WZ4002耐葯。然而E7050使HCC827ER，PC-9/HGF和H1975細胞系對WZ4002敏感，二者聯合抑制EGFR和MET激活和下游基因。Nanjo S等顯示聯合克唑替尼和阿法替尼或WZ4002有效抑制HGF基因激活，T790M突變和Met擴增三種類型細胞。

Ortiz-Zapater E等檢測MET和EGFR二聚體的相互作用，發現EGFR與MET的二聚體與不同的EGFR突變類型有關。在異種移植模型，對於H1975細胞系L858R和T790M同時突變，MET抑製劑SGX523顯著減少了此細胞系的細胞增殖、腫瘤生長以及降低ERK的激活。但在H1975細胞系L858R突變和H1975 EGFR野生，這種效果沒有出現。SGX523隻降低H1975細胞系L858R和T790M同時突變的EGFR-MET二聚體的基質形成，但誘導H1975細胞系L858R突變二聚體形成，H1975 EGFR野生沒有受影響。

2、FGFR

FGFR（纖維細胞生長因子受體）對腫瘤的血管形成很重要，也常與EGFR-TKI耐葯有關。

Jakobsen KR等調查EGFR抑製劑並行獲得性耐葯機制。使用HCC827,一個EGFR突變肺腺癌細胞系依賴EGFR活性和對厄洛替尼敏感。厄洛替尼耐葯後變成HCC827ER細胞系，此細胞系混雜上皮表型（未轉移）和間充質表型（開始轉移EMT）。為了澄清可能的耐葯機制，建立14個耐葯子克隆。有趣的是，耐葯子克隆或存在MET擴增(6/14)或經歷EMT (8/14)，這2類都對厄洛替尼耐葯，但只有MET子克隆對MET抑製劑克唑替尼和capmatinib有應答，而EMT子克隆有驚人的FGFR1升高表達並對FGFR抑製劑AZD4547有應答。然而MET子克隆沒有可監控的基因表達，發現FGFR1表達的上調是對厄洛替尼早期反應。一旦暴露於厄洛替尼48小時，FGFR1表達就增加。EMT子克隆高FGFR1表達很穩定，即使厄洛替尼停葯很長一段時間也一樣。說明了FGFR1在厄洛替尼耐葯中的作用。

Azuma K等研究阿法替尼的耐葯機制。與未耐葯的PC9細胞系相比，得出[1] EGFR家族蛋白的表達驚人下調；[2] FGFR1和其配體FGF2必有一個上調；[3]治療FGF2中和抗體阻止耐葯克隆FGFR1激活的增強；[4]耐葯克隆對PD173074敏感，一個小分子FGFR抑製劑，聯合阿法替尼治療抑制了阿法替尼耐葯細胞Akt和ERK激活；[5] twist表達在耐葯克隆驚人擴張，而twist的敲除特異性抑制FGFR表達和細胞生存。總之，FGFR1和FGF2表達增強是一個阿法替尼耐葯癌細胞生存的逃逸機制。

Ware KE等調查EGFR抑製劑的耐葯機制。除了T790M看門突變和MET擴增外，在EGFR抑製劑適應性誘導耐葯的HCC4006，HCC2279和H1650細胞系出現驚人FGF2和FGFR1 mRNA和蛋白水平。在HCC4006耐葯的細胞聯合吉非替尼和AZD4547，一個FGFR特異性抑製劑，阻止耐葯克隆的過度生長。在最初對EGFR抑製劑敏感的肺癌亞群，EGFR特異性抑製劑慢性誘導的FGF2和FGFR1提供了一個新的自分泌受體酪氨酸激酶（RTK）驅動旁路耐葯機制。表明EGFR抑製劑聯合FGFR抑製劑是一個有價值的EGFR突變的NSCLC治療方法。

圖4.7 FGF/FGFR信號通路圖（David M. Ornitz，etal.Genes Dev. 2015 Jul 15; 29(14): 1463–1486.）。

3、TGFβ信號通路和EMT

轉化生長因子β（TGFβ）和受體TβR是胞內信號轉導的重要通路，能調控細胞增殖、遷移和粘附等生物學效應，通過介導腫瘤細胞、微環境以及兩者間相互作用，創造一個有利於腫瘤發展的環境。因此TGFβ成為腫瘤治療新靶點，但其調控機制複雜，所以靶向治療風險很大。此外，HGF和TGF-β1的表達在非小細胞肺癌的發生、發展及轉移過程中充當著重要作用，且二者密切相關。EMT狀態可部分反映EGFR-TKI治療的敏感程度，TGF-β1可誘導PC9細胞發生EMT，從而影響PC9細胞對吉非替尼的敏感性，這種效應可能是通過持續活化AKT和STAT3而發揮作用。目前臨床無可用抑製劑，據研究，二甲雙胍、白藜蘆醇、src抑製劑等可抑制TGF-β1。

圖4.8 TGF-β與EMT關係圖（Joan Massagué. Cell. 2008 Jul25; 134(2): 215–230.通過細胞與細胞接觸調節因子par6的磷酸化和SNAIL或SLUG刺激惡性細胞在間充質細胞之間互換表型。惡性細胞也可以開關分化抑制因子ID1向間充質細胞表型分化為具有侵犯和轉移的EMT並逆轉為MET）。

4、PI3K/AKT/mTOR信號通路

PI3K/AKT/mTOR信號通路能夠抑制細胞凋亡，促進細胞生存，加快細胞周期，促血管生成和腫瘤侵襲轉移。生長因子通過跨膜受體信號轉導激活磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)，腫瘤抑制基因PTEN（同源性磷酸酶和張力蛋白）的失活使得PI3K增加，AKT（PKB，蛋白激酶B）活性增強，激活mTOR（哺乳動物雷帕黴素）使細胞發生分化。而mTOR能直接激活STAT3，促進信號轉錄。PI3K/AKT/mTOR信號通路是EGFR-TKI耐葯的主要原因之一。

Dong S等在吉非替尼耐葯的細胞系，使用依維莫司聯合吉非替尼，顯示增加依維莫司劑量，更強地抑制mTOR激活和下游p70S6K激活表達，同時降低激活的AKT和MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）表達水平。Fei SJ等研究mTOR信號通路在EGFR抑製劑敏感和耐葯細胞系的差異。選擇4個EGFR抑製劑敏感和耐葯的不同NSCLC細胞系：PC9, PC9GR, H1650和H1975細胞模型，檢測mTOR相關的信號通路的差異。EGFR抑製劑耐葯的細胞系顯示更高的mTORC2（mTOR敏感複合體2）激酶活性，而敏感細胞系顯示更高的mTORC1（mTOR敏感複合體1）激酶活性。ATP競爭性mTOR抑製劑ku-0063794顯示驚人的抗增殖效果和G1細胞周期的阻滯在敏感和耐葯細胞系。Ku-0063794在IC50（有效抑制濃度的50%）濃度有效地抑制mTOR和p70S6K（mTORC1基質）活化水平。說明EGFR抑製劑耐葯與mTORC2信號通路相關。

5、Ras/Raf/MEK/ERK信號通路

Ras/Raf/MEK/ERK通路也是EGFR抑製劑耐葯最重要信號通路之一，也稱為Ras-MAPK通路，其核心是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），又稱細胞外調節蛋白激酶（ERK），而MEK就是MAPK激酶（MAPKK）。在多種惡性腫瘤細胞內普遍存在MAPK的持續激活，這提示MAPK在細胞惡性轉化過程中具有重要作用。多種致癌刺激因子可以通過不同MAPK信號通路的不同環節誘導細胞的過度增殖和癌變。MAPK降低細胞的黏附能力，誘導細胞侵襲和轉移。MAPK通路在治療耐葯中發揮重要作用，可引起多葯耐葯蛋白p-gp表達增加。

圖4.9 Ras信號通路圖（Ruth Nussinov,et al.Oncotarget. 2014 Sep; 5(17):7285–7302.）。

Li S, Chen S等認為聯合不同信號通路抑製劑是一種很有前途的策略來克服EGFR抑製劑的耐葯問題。將絲裂原蛋白激酶的激酶1/2（MEK1/2）抑製劑，AZD6244，與吉非替尼聯合使用，以研究這種治療在NSCLC細胞系中的效果，特別是在吉非替尼耐葯細胞。在人NSCLC細胞系，EGFR抑製劑敏感的PC-9（EGFR突變/野生K-Ras）和EGFR抑製劑耐葯的A549（EGFR野生/ K-Ras突變）單獨使用AZD6244治療，或單獨使用吉非替尼或兩種藥物的聯合治療，並分析細胞增殖和信號通路的改變。結果表明，吉非替尼和AZD6244聯合治療的生長抑制效果比吉非替尼單獨在EGFR抑製劑耐葯的A549細胞有更大的生長抑制效果。單用吉非替尼治療A549細胞就可以降低Akt激活形式的表達水平，兩種藥物的結合顯示出更強的抑制Akt磷酸化和細胞外信號調節激酶ERK的磷酸化。數據顯示，AZD6244和吉非替尼聯合在吉非替尼耐葯的NSCLC細胞中表現出了劑量有關的協同作用。

6、JAK/STAT信號通路

JAK是Janus激酶，STAT即信號轉導子和轉錄激活子。JAK/STAT信號通路是多種細胞生長、活化、分化、凋亡中的重要的胞內信號通路。許多細胞因子經細胞因子受體能激活JAK/STAT。JAK/STAT信號通路在NSCLC中呈過度激活狀態，促癌細胞惡變、增殖、多葯耐葯。

Gao SP等指出持久活化或酪氨酸磷酸化STAT3 (pSTAT3)在50%肺腺癌中發現。在原發性腺癌和細胞系具有體細胞激活突變的EGFR的酪氨酸激酶域中發現pSTAT3。使用EGFR抑製劑或src激酶抑製劑對這些細胞系的治療沒有影響pSTAT3水平，而泛JAK抑製劑（P6）阻斷了STAT3的激活和抑制腫瘤的發生。表達這些持續激活突變的EGFR細胞系也產生了很高的IL-6水平，並且對IL-6/gp130/JAK通路的封鎖導致了pSTAT3水平的下降。通過RNA干擾減少IL-6水平，導致腫瘤生成的減少。此外，對多個細胞系的EGFR活性的抑制部分阻斷了IL-6的轉錄，並同時降低了IL-6的產量和釋放量。免疫組織化學分析揭示原發性肺腺癌的pSTAT3和IL-6陽性之間的正相關。因此，突變EGFR可以通過在原發性人類肺腺癌中上調IL-6、激活gp130/JAK/STAT3信號通路，使這一通路成為癌症治療的潛在靶點。

圖4.10 JAK/STAT信號通路圖（Tracey JMitchell,et al. Immunology. 2005 Mar; 114(3): 301–312.細胞因子激活JAK，然後導致STAT單體或二聚體磷酸化。通過核輸入複合體，激活的二聚STAT被積極傳輸到細胞核。一旦活化的STAT進入細胞核，就與基因啟動子結合併激活基因進入轉錄階段。STAT從細胞核DNA釋放出來只能通過核磷酸酶的去磷酸化，滅活的STAT通過輸出複合體從細胞核排出到細胞質。而單體STAT可自由穿梭於細胞質和細胞核，便於核蛋白交互。）。

Gao SP, Chang Q等發現JAK/STAT信號通路與異常增加於EGFR激活突變抑製劑耐葯的NSCLC中，抑制JAK2恢復耐葯細胞對厄洛替尼的敏感性。抑制JAK2把EGFR從JAK負調節因子細胞因子信號抑制蛋白5 (SOCS5)的結合中解離出來，隨後增加EGFR的大量表達和恢復腫瘤細胞依賴EGFR信號。而且，抑制JAK2突變或野生EGFR亞單元的異源二聚體，使其活性被EGFR抑製劑所抑制。表明JAK2抑制克服EGFR抑製劑的耐葯，支持JAK和EGFR抑製劑聯合治療EGFR突變的NSCLC。

7、ERK/AKTcrosstalk（串聯）

ERK與AKT原本不是一條通路上，但由於信號的crosstalk使得二者產生相互串聯激活，可見聯合抑制ERK/AKT信號非常重要。

Xu ZH等研究NSCLC EGFR野生患者使用厄洛替尼治療不同的敏感水平。使用3個EGFR野生NSCLC細胞系(U1752, Calu-6和NCI-H292)對厄洛替尼的治療效果的差異進行分析。RAF1 (c-raf)，MAP2K1 (MEK1)，SNAIL和下游信號分子ERK和AKT在厄洛替尼耐葯的細胞系激活。ERK和AKT激活恰好是從厄洛替尼敏感一步步走到厄洛替尼耐葯。因此，RAF1-MEK1-ERK/AKT軸是EGFR野生NSCLC細胞系厄洛替尼耐葯的原因。

Wan J, Wu W發現癌症殘留細胞對熱療的適應和生長是通過缺氧誘導因子HIF-1a誘導的，在適應47 °C的NSCLC細胞HIF-1a表達是AKT和ERK所調節。AnthonyW. Tolcher等聯合MET抑製劑司美替尼（AZD6244，每天100mg）和AKT抑製劑MK-2206（135mg每周）治療Ras突變的NSCLC患者，取得普遍持久效果。

Ren H等調查NVP-BKM120(BKM120，PI3K抑製劑)誘導細胞自噬的效果和生長抑制活性。溶酶體蛋白酶抑製劑氯喹進一步增強BKM120抑制效果。自噬是腫瘤細胞自我保護機制對抗BKM120。有趣的是，BKM120增加ERK1/2磷酸化水平。使用MEK抑製劑或敲除ERK1/2阻止自噬信號，BKM120的生長抑制效果被增強，意味著MEK/ERK激活有助於BKM120誘導的自噬。在老鼠異種移植模型，聯合BKM120和PD0325901（MEK抑製劑）協同抑制人類肺癌細胞的生長。

Coco S等調查阿法替尼的耐葯機制，使用2個NSCLCEGFR突變細胞系(NCI-H1650和NCI-H1975)，分析了涉及EGF信號通路的92個基因表達。2個細胞系的基線基因表達顯示NCI-H1650細胞系對阿法替尼的應答更差，並激活EGFR下游通路如PI3K/AKT和PLCγ/PKC軸。阿法替尼耐葯的細胞系分析顯示PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路激活伴隨著EMT生物學表型的轉換，確定了阿法替尼的耐葯。

8、Src

Src屬Src家族激酶（SFK）家族成員，是人類c-Src基因產物。存在於細胞質，是非受體酪氨酸激酶。許多刺激因素都可以激活Src，再激活Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt信號通路。Src可被PDGFR、EGFR激活，再活化STAT3/c-Myc信號通路，加快細胞周期轉換，介導細胞生存、減弱細胞粘附力、促轉移，有助於血管生成。

Ochi N等發現吉非替尼大體上抑制EGFR信號通路，而耐葯的PC-9細胞ERK被重新激活，未耐葯細胞則沒有。吉非替尼聯合ERK抑製劑（U0126）在PC9細胞系恢復了吉非替尼的敏感性，但用LY294002（PI3K抑製劑）不能抑制PI3K-Akt。雖然Src的酸化水平上調同步ERK重新激活，ERK抑制或ERK特異的siRNA都不能誘導Src磷酸化。此外，EGFR和Src的雙重抑制，在體外和體內恢復了吉非替尼的敏感性。Src介導的ERK重新激活可能是新的吉非替尼耐藥性機制，吉非替尼與Src抑製劑聯合使用可能是克服這種耐藥性的有效策略。

Filosto S等提出Src作為一個靶點介導吸煙誘導的EGFR抑製劑耐葯，既在EGFR野生細胞系也在EGFR L858R突變細胞系。在A549細胞，煙草煙霧暴露會導致與時間有關的Src活化，然後異常地結合到野生EGFR導致抑製劑耐葯，這與之前觀察結果形成了對比，即滅活的Src與EGFRL858R突變對EGFR-TKI敏感。而抑制Src能恢復在煙草煙霧暴露的NSCLC細胞對TKI的敏感性。此外，一個負調節Src的Y527F/K295R（基因片段）的過度表達也可以恢復暴露於香煙煙霧的A549細胞對TKI敏感度。重要的是，即使在香煙煙霧暴露的EGFRL858R細胞出現TKI耐葯也可以通過抑制Src而消除。這些發現為使用Src抑製劑治療NSCLC吸煙者中常見的耐葯提供了新的依據。

Yoshida T等指出激活MET, IGF, AXL受體酪氨酸激酶RTK能保護PC9吉非替尼耐葯細胞拮抗不可逆EGFR抑製劑阿法替尼。從而確認一個Src家族激酶(SFK)網路是EGFR獨立耐葯機制，也確認厄洛替尼或阿法替尼不能影響Src磷酸化的激活位點。SFK抑製劑達沙替尼聯合阿法替尼抑制了Src磷酸化和完全抑制其下游的Akt和Erk的磷酸化。而且，達沙替尼進一步加強了阿法替尼的抗癌活性，或增強了多個T790M介導耐葯的NSCLC細胞系使用T790M抑製劑(WZ4006)抗增殖和抗凋亡的能力。

圖4.11 src相關信號通路圖（Jeffrey D. Bjorge,et al.PLoS One. 2011; 6(4): e19309.）。

9、AXL

AXL(Anexelekto；Greek for「uncontrolled」希臘語意思是「不受控」)是一種進化晚期才出現的受體型酪氨酸激酶。最近發現其過度表達可介導腫瘤化療產生的多種耐藥性，但具體的分子機制還不明確。AXL的靶向抑製劑R428已於2011年進入臨床I期。不過還好的是XL184也抑制AXL。AXL與配體GAS6結合可激活AXL的酪氨酸激酶活性,激活下游信號轉導途徑。參與細胞黏附與識別、細胞增殖、抗凋亡、凝血、炎症反應等過程。AXL基因異常表達在多種腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用,包括抑制腫瘤細胞凋亡，參與腫瘤性血管生成及侵襲等病理過程。

圖4.12 AXL信號通路圖（Ross AOkimoto,et al. Lung Cancer (Auckl). 2015; 6: 27–34.）

Wu Z等研究AXL和EGFR及突變狀態之間關係。評估109位肺腺癌患者有或沒有EGFR突變，68 (62.4%)患者有EGFR突變如19 del或L858R；2位患者T790M突變。檢測結果是109位患者AXL，EGFR和磷酸化EGFR（pEGFR）的表達分別是60 (55%)，68(62.4%)和57 (52.3%)。在EGFR激活突變68位患者中AXL(+)/EGFR(+)/pEGFR（+）一起表達的百分比明顯高於39位EGFR野生患者(30.9% vs 10.3%)。此外，在AXL(+)患者子組，35位EGFR突變和23位野生，AXL(+)/pEGFR(+)和AXL(+)/EGFR(+)/pEGFR(+)在EGFR突變的患者明顯高於EGFR野生患者。說明AXL和EGFR共表達於EGFR突變和野生NSCLC患者，聯合二者抑製劑可以預防和延長無論是否EGFR突變AXL陽性的NSCLC患者耐葯問題。

Zhang Z等研究厄洛替尼耐葯非T790M突變和MET激活的其他機制。發現在多個EGFR突變的NSCLC體內外模型中增加AXL的激活和EMT證據。在這些腫瘤模型，基因或藥物抑制AXL恢復了厄洛替尼的敏感性。增加AXL表達和AXL配體GAS6表達在獲得性EGFR抑製劑耐葯的EGFR突變肺癌個體中發現。說明AXL是一個有希望的靶點，抑制AXL能阻止或克服EGFR抑製劑的獲得性耐葯。

Brand TM等顯示腫瘤細胞對治療多種癌症的EGFR抗體西妥昔單抗還是存在先天和後天的耐葯。在非小細胞肺癌(NSCLC)和頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)模型，過度表達的致癌受體酪氨酸激酶AXL足以調節西妥昔單抗獲得性耐葯。AXL過表達，激活，與EGFR表達的西妥昔單抗耐葯的細胞密切相關。利用RNAi（RNA干擾）方法和新AXL靶向藥物，發現AXL激活刺激細胞增殖，EGFR激活，以及西妥昔單抗耐葯細胞中的MAPK信號。值得注意的是，在西妥昔單抗耐葯的細胞中，EGFR通過MAPK信號和轉錄因子c-Jun直接調節了AXL信使mRNA的表達，形成了一個正反饋迴路，AXL維持EGFR激活。西妥昔單抗敏感的父系細胞，通過穩定的AXL過表達或EGFR配體的刺激，就對西妥昔單抗產生耐藥性。在腫瘤異種移植模型中，西妥昔單抗長期治療後出現的耐藥性與AXL超活化和EGFR相關。總之，AXL是西妥昔單抗的關鍵調節基因，為臨床評價AXL靶向藥物治療西妥昔單抗耐葯的癌症提供了理論依據。

Wu F等研究AXL在非小細胞肺癌（NSCLC）藥物耐藥性及上皮-間充質轉換（EMT）中所起的作用。在EGFR野生的NSCLC患者中，AXL是一個很有希望的治療靶點。與AXL過表達的腫瘤細胞相比，當AXL下調時，腫瘤細胞對厄洛替尼的應答更敏感。進一步的研究表明，當AXL下調，EMT標記物上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）增加，神經鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）降低。表明AXL的抑制可以逆轉EMT。在NSCLC患者TKI治療沒有耐藥性時，聯合AXL抑製劑和EGFR-TKI治療策略可能更有效。

Tian Y等指出AXL與EGFR同享下游信號通路，如PI3K/AKT和MAPK/ERK。是否PC9細胞吉非替尼耐葯與AXL表達和下游靶點的表達增加有關。是否敲除AXL在耐葯的PC9細胞系和未耐葯過表達AXL的PC9細胞系能夠恢復或提高耐葯細胞對吉非替尼的敏感性。結果是靜默AXL能夠使耐葯細胞對吉非替尼敏感，以及下游信號通路也同樣被抑制。而增加AXL表達確實促進耐葯，以及下游靶點相應激活。招募69位EGFR突變NSCLC患者，分析AXL的表達和AXL與臨床相關性。5/69位患者是AXL陽性(7%)，而且AXL與腫瘤分化和大小有關。AXL介導的耐葯涉及PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2活性增加。

10、HER2

EGFR可與配體結合後，與HER家族成員形成同源或異源二聚體，其中EGFR/HER2二聚體最穩定，因而HER2在EGFR的信號轉導中起重要作用。HER2參與介導EGFR抑製劑的耐葯。

Takezawa K等調查HER2在EGFR突變腫瘤細胞中作用。在體內外顯示阿法替尼+西妥昔單抗顯著抑制HER2活化。在研究的細胞系，HER2過表達或敲除分別與阿法替尼的耐葯或敏感相關。HER2擴增在獲得性耐葯的腫瘤為12%，而在未治療的肺腺癌只有1%。尤其是，HER2擴增與EGFR(T790M)是相互排斥的。HER2是EGFR突變獲得性耐葯的一種機制。

11、IGFR

促腫瘤活性的胰島素生長因子（IGF）主要通過胰島素生長因子受體（IGF-IR）介導的。IGF-IR在一些惡性腫瘤中都出現表達上調。IGF-IR是細胞發生轉化所必須的，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡；與其他生長因子的信號通路相互作用；與其他促瘤機制協同實現促腫瘤作用。

圖4.13 IGFR信號通路圖（Ling Li,etal.Oncotarget. 2017 Nov 3; 8(54): 92240–92253.）

Ling Li等探討了IGF1R信號在EGFR突變NSCLC細胞EGFR TKI耐葯相關的EMT表型獲得中的作用。與吉非替尼敏感的父系細胞相比，吉非替尼耐葯細胞表現出與增加遷移和侵犯能力相關的EMT表型，同時激活IGF1R和NF-κB p65信號。使用藥物抑製劑或特定的干擾siRNA抑制IGF1R或p65蛋白，部分恢復吉非替尼的敏感性，同時在吉非替尼細胞中逆轉EMT。相反，外源性IGF1在父系細胞中誘發了吉非替尼耐葯和伴隨的EMT。此外，還顯示IGF1R可以磷酸化下游的Akt和Erk以激活NF-κB p65。表明IGF1R/Akt/Erk/NF-κB信號通路與EGFR突變的NSCLC獲得性EGFR TKI耐葯和EMT表型有關，並且可能是晚期NSCLC一個新的治療靶點。

Peled N等調查吉非替尼耐葯與IGF-IR表達之間關係。檢測17個吉非替尼耐葯細胞系，然而3個細胞系還是敏感的，3個細胞系顯示了中等敏感性。13個耐葯細胞系總IGF-IR表達陽性，而所有敏感的細胞系均為陰性，結果為陽性預測值81%的總IGF-IR預測吉非替尼耐葯。7個耐葯細胞系表現出高磷酸化IGF-1R水平，而所有3種敏感的細胞系磷酸化IGF-1R為負，因此磷酸化IGF-1R的預測耐葯有效性為100%。通過外源性IGF-1表達，無論是對IGF-1R表達的敲除，還是IGF-IR通路的激活都沒有影響吉非替尼的敏感性。在原發性NSCLC組織中，IGF-1R表達在進展性等疾病患者中明顯更高，與那些完全或部分反應的人相比，顯示吉非替尼耐葯。高以及磷酸化IGF-1R可以作為NSCLC細胞系和NSCLC患者對吉非替尼耐葯的一個預測因子，但似乎並沒有對吉非替尼的原發耐葯起作用。

Zhou J等調查吉非替尼和厄洛替尼的耐葯與EMT和IGF-IR之間關係。比較EGFR突變(PC-9)或EGFR野生(H460)NSCLC細胞系，與父系細胞相比，EGFR抑製劑耐葯的PC-9/GR和H460/ER細胞顯示一個EMT表型和過表達IGF-IR。SiIGF1R（抑制IGF-IR）在PC-9/GR和H460/ER細胞逆轉EMT相關的形態和EGFR抑製劑的耐葯。外源性IGF-1隻能誘導沒有EGFR抑製劑治療的PC-9和H460細胞的EMT，增加它們對EGFR抑製劑的耐葯。包括TGF-β1誘導的EMT在PC-9和H460細胞並降低對EGFR抑製劑的敏感性。而通過上皮細胞鈣黏蛋白E-cadherin的過表達逆轉EMT，恢復對EGFR抑製劑的敏感性在耐葯PC-9/GR和H460/ER細胞系。說明IGF-IR誘導EMT在EGFR抑製劑的獲得性耐葯中起重要作用。

12、EGFR抑製劑誘導自身耐葯

以上都是別的因素誘導EGFR抑製劑耐葯，由於腫瘤異質性，腫瘤細胞在抑製劑的打擊下四處尋找生路，或耐受打擊的細胞演化為幹細胞，舉起抗擊抑製劑的大旗。

2014年5月出版的cancer discovery發表了EGFRInhibitors May Induce Tumor Stemness一文。文中指出NSCLC EGFR突變患者服用特羅凱等抑製劑後產生耐葯的細胞類似幹細胞。這些細胞表達CD61，導致抑製劑耐葯。CD61表達增加NF-κB的活性。腫瘤細胞需要NF-κB通路變成具有幹細胞特徵並導致耐葯。使用NF-κB抑製劑硼替佐米聯合特羅凱使CD61消失，並恢復特羅凱的敏感性。

Shien K等調查幹細胞出現與導致吉非替尼耐葯的關係。在HCC827衍生的子系細胞高濃度暴露于吉非替尼不但表現EMT特徵也表現幹細胞樣屬性，包括乙醛脫氫酶(ALDH1A1)過表達，增加側群細胞和自我更新能力。這些耐葯細胞對化療藥物耐葯但對組蛋白去乙醯化抑製劑和蛋白酶體抑製劑敏感。

13、小細胞肺癌

EGFR抑製劑耐葯後轉化為小細胞肺癌，只見多起報道，至於治療寥寥無幾。小細胞肺癌最大的特徵是未分化和視網膜母細胞瘤（RB1）突變。

Shi X等假設2種EGFR抑製劑耐葯而產生的細胞表型的轉換：非小細胞肺癌轉變為小細胞肺癌（SCLC）。1)腺癌轉換為SCLC是由於抑製劑治療的壓力；2)一開始SCLC與腺癌共存,但在抑製劑使用前腫瘤活檢標本尚未檢測出腫瘤異質性。在前者中，SCLC與腺癌具有相同的遺傳特徵，強烈建議這種轉變是TKI治療的結果。在後一種情況下，混合腺癌的SCLC的基因變異和蛋白質表達成分在NSCLC和SCLC之間存在差異。結果表明，轉變為小細胞肺癌的NSCLC成分通常表達EGFR和RB1，而SCLC成分卻沒有。這一發現表明，儘管存在敏感的EGFR突變，但NSCLC和SCLC成分是不同的，混合腺癌的SCLC不適合進行TKI治療。

Matthew J. Niederst等分析EGFR突變耐葯的腫瘤標本和衍生細胞系，發現出現小細胞轉換的個案100%存在RB缺失，但這種情況在耐葯後依舊是NSCLC患者身上幾乎不存在。此外，耐葯轉換的CSC與耐葯的NSCLC相比，觀察到增加神經內分泌標記和降低EGFR表達，以及對BCL2家族抑製劑更敏感。表明這種耐藥方式最終接受典型CSC表型特徵。

Watanabe S等報道一例52歲女性肺腺癌使用EGFR抑製劑治療。在疾病進展後，二次活檢標本顯示小細胞肺癌(SCLC)，對化療敏感，腫瘤標誌物包括ProGRP和NSE升高。可見，後續治療再次活檢很重要，治療標誌物ProGRP和NSE可以更早預測EGFR治療的耐葯。

圖4.14肺腺癌轉換為小細胞肺癌假設示意圖（Yingjiao Xue,et al.ProteinCell. 2017 Mar; 8(3): 178–190.）。

14、其他

Wang Z等發現EGFR突變肺癌患者在EGFR-TKI耐葯的細胞內發現ERβ（雌激素受體β）存在，根據ERβ不同定位分為細胞質內和細胞核內。二個地方都表達佔12%（22/184，共184人），與預後效果差相關。二個地方都有表達比只在細胞質內表達更易使吉非替尼耐葯。不過，吉非替尼聯合氟維司群可逆轉吉非替尼耐葯。表明細胞質內和細胞核內同時表達的ERβ是EGFR-TKI的治療靶點。

Choe C等研究hedgehog信號通路與癌症相關纖維細胞介導的厄洛替尼耐葯中作用。PC9細胞系，EGFR突變的NSCLC細胞系對厄洛替尼耐葯。結果是在PC9細胞系癌症相關纖維細胞誘導EMT，並出現EMT的相關蛋白標誌物包括波形蛋白。癌症相關纖維細胞誘導7次跨膜蛋白smoothened上調，是hedgehog一個中心信號轉導因子，說明hedgehog信號通路在癌症相關纖維細胞介導的厄洛替尼耐葯中具有活性。使用smoothened拮抗劑環巴胺下調了smoothened活性。表明hedgehog信號與癌症相關纖維細胞之間的crosstalk在EGFR抑製劑耐葯中起重要重要。

Zou Q等指出BIM刪除的多態性明顯與EGFR突變NSCLC患者EGFR抑製劑治療的客觀應答率(ORR)和疾病控制率(DCR)差相關，而且無進展生存時間(PFS)更短。

（BIM (Bcl-2細胞死亡交互調節蛋白)是新近發現的Bcl-2蛋白家族促凋亡成員之一，最近的研究發現, Bim基因作為抑癌基因,其表達缺失可促使多種腫瘤的發生。）

Bidkhori G等模擬顯示在存在PTEN表達水平情況下，厄洛替尼治療抑制ERK、Akt和STAT3的激活；在PTEN缺失的情況下厄洛替尼不能降低ERK、Akt和STAT3表達。

（PTEN是抑癌基因，通過去磷酸化參與細胞調控，在腫瘤的發生、發展中起重要作用。是繼P53蛋白後與腫瘤發生關係密切的重要基因。）

參考文獻：

1、林桐榆,於世英,焦順昌.惡性腫瘤靶向治療.人民衛生出版社.2016年11月.

2、余元勛等.中國疾病信號通路與靶向治療學.安徽科學技術出版社.2013.5

3、李恩孝.噁心腫瘤分子靶向治療.人民衛生出版社.2011年7月第二版.

4、司履生.癌基因、抑癌基因與腫瘤相關基因.院西科學技術出版社，2002.12.

5、成軍.現代腫瘤基因分子生物學. :科學出版社.2014.9

6、余元勛,王勇,陸友金.中國分子肺癌學.2015年8月.

7、Yuxin Lin, et al. EGFR-TKI resistance in NSCLCpatients: mechanisms and strategies.Am J Cancer Res. 2014; 4(5): 411–435.

8、Jordi Remon1 and Benjamin Besse.Unravelling signalescape through maintained EGFR activation in advanced non-small cell lungcancer (NSCLC): new treatment options. ESMO Open. 2016; 1(4): e000081.

9、Liu Y,et al. Meta-analysis of the impact of de novo andacquired EGFR T790Mmutations on the prognosis of patients with non-small cell lung cancerreceiving EGFR-TKIs. Onco Targets Ther. 2017 Apr 24;10:2267-2279.

10、Thress KS,et al. Acquired EGFR C797S mutation mediatesresistance to AZD9291 innon-small cell lung cancer harboring EGFR T790M.Nat Med. 2015 Jun;21(6):560-2.

11、Avizienyte E,et al. Comparison of the EGFR resistancemutation profiles generated by EGFR-targeted tyrosine kinase inhibitors and theimpact of drug combinations. Biochem J. 2008 Oct 15;415(2):197-206.

12、Tang ZH,et al. Characterization of osimertinib(AZD9291)-resistant non-small cell lung cancer NCI-H1975/OSIR cell line.Oncotarget. 2016 Dec 6;7(49):81598-81610.

13、Martin MJ,et al. Inhibition of oxidativephosphorylation suppresses the development of osimertinib resistance in apreclinical model of EGFR-driven lung adenocarcinoma. Oncotarget. 2016 Dec27;7(52):86313-86325.

14、Ichihara E,et al. SFK/FAK Signaling AttenuatesOsimertinib Efficacy in Both Drug-Sensitive and Drug-Resistant Models ofEGFR-Mutant Lung Cancer. Cancer Res. 2017 Jun 1;77(11):2990-3000.

15、Eberlein CA,et al. Acquired Resistance to theMutant-Selective EGFR Inhibitor AZD9291 Is Associated with Increased Dependenceon RAS Signaling in Preclinical Models. Cancer Res. 2015 Jun15;75(12):2489-500.

16、Cath Eberlein,et al. ERK pathway activation isassociated with acquired resistance to AZD9291, a third-generation irreversibleinhibitor targeting EGFR sensitizing (EGFRm+) and resistance (T790M) mutations in NSCLC. Clinical cancerresearch.2015 Feb

17、Ou SI, Agarwal N, Ali SM. High MET amplification levelas a resistance mechanism to osimertinib (AZD9291) in a patient thatsymptomatically responded to crizotinib treatment post-osimertinib progression.Lung Cancer. 2016 Aug;98:59-61.

18、Ercan D,et al. EGFR Mutations and Resistance toIrreversible Pyrimidine-Based EGFR Inhibitors. Clin Cancer Res. 2015 Sep1;21(17):3913-23.

19、Matthew J. Niederst,et al. The allelic context of theC797S mutation acquired upon treatment with third generation EGFR inhibitorsimpacts sensitivity to subsequent treatment strategies. Clin Cancer Res. Authormanuscript; available in PMC 2016 Sep 1.Published in final edited form as: ClinCancer Res. 2015 Sep 1; 21(17): 3924–3933.

20、Kim TM,et al. Mechanisms of Acquired Resistance toAZD9291: A Mutation-Selective, Irreversible EGFR Inhibitor. J Thorac Oncol.2015 Dec;10(12):1736-44.

21、Della Corte CM,et al. Antitumor efficacy of dualblockade of EGFR signaling by osimertinib in combination with selumetinib orcetuximab in activated EGFR human NSCLC tumor models. J Thorac Oncol. 2018 Mar8. pii: S1556-0864(18)30181-3.

22、Uchibori K,et al. Brigatinib combined with anti-EGFRantibody overcomes osimertinib resistance in EGFR-mutated non-small-cell lungcancer. Nat Commun. 2017 Mar 13;8:14768.

24、Mizuuchi H,et al. Oncogene swap as a novel mechanism ofacquired resistance to epidermal growth factor receptor-tyrosine kinaseinhibitor in lung cancer. Cancer Sci. 2016 Apr;107(4):461-8.

25、Nanjo S,et al. MET Copy Number Gain Is Associated withGefitinib Resistance in Leptomeningeal Carcinomatosis of EGFR-mutant LungCancer. Mol Cancer Ther. 2017 Mar;16(3):506-515.

26、Nakagawa T,et al. Combined therapy with mutant-selectiveEGFR inhibitor and Met kinase inhibitor for overcoming erlotinib resistance inEGFR-mutant lung cancer. Mol Cancer Ther. 2012 Oct;11(10):2149-57.

27、Nanjo S,et al. Ability of the Met kinase inhibitorcrizotinib and new generation EGFR inhibitors to overcome resistance to EGFRinhibitors. PLoS One. 2013 Dec 26;8(12):e84700.

28、Ortiz-Zapater E,et al. MET-EGFR dimerization in lungadenocarcinoma is dependent on EGFR mtations and altered by MET kinaseinhibition. PLoS One. 2017 Jan 31;12(1):e0170798.

29、Valerie Nelson,et al.Afatinib: emerging next-generationtyrosine kinase inhibitor for NSCLC.Onco Targets Ther. 2013; 6: 135–143.

30、Yamaoka T,et al. Distinct Afatinib ResistanceMechanisms Identified in Lung Adenocarcinoma Harboring an EGFR Mutation. MolCancer Res. 2017 Jul;15(7):915-928.

31、Wu SG,et al. The mechanism of acquired resistance toirreversible EGFR tyrosine kinase inhibitor-afatinib in lung adenocarcinomapatients. Oncotarget. 2016 Mar 15;7(11):12404-13.

32、Wang Z,et al. ERβ localization influenced outcomes ofEGFR-TKI treatment in NSCLC patients with EGFR mutations.Sci Rep. 2015 Jun22;5:11392.

33、Lee Y,et al. Inhibition of IGF1R signaling abrogatesresistance to afatinib (BIBW2992) in EGFR T790Mmutantlung cancer cells. Mol Carcinog. 2016 May;55(5):991-1001.

34、van Hoppe S,et al. Breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2) and P-glycoprotein (P-gp/ABCB1) transport afatinib and restrictits oral availability and brain accumulation. Pharmacol Res. 2017Jun;120:43-50.

35、Rachel N. Frisch,et al. Hepatocyte Growth Factor andAlternative Splice Variants - Expression, Regulation and Implications inOsteogenesis and Bone Health and Repair.Expert Opin Ther Targets. Authormanuscript; available in PMC 2017 Sep 1.

36、Jakobsen KR,et al. MET amplification andepithelial-to-mesenchymal transition exist as parallel resistance mechanisms inerlotinib-resistant, EGFR-mutated, NSCLC HCC827 cells. Oncogenesis. 2017 Apr3;6(4):e307.

37、Azuma K,et al. FGFR1 activation is an escape mechanismin human lung cancer cells resistant to afatinib, a pan-EGFR family kinaseinhibitor. Oncotarget. 2014 Aug 15;5(15):5908-19.

38、Ware KE, A mechanism of resistance to gefitinibmediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1autocrine growth loop. Oncogenesis. 2013 Mar 25;2:e39.

39、David M. Ornitz，et al.Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease.GenesDev. 2015 Jul 15; 29(14): 1463–1486.

40、Choe C,et al. Crosstalk with cancer-associatedfibroblasts induces resistance of non-small cell lung cancer cells to epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibition. Onco Targets Ther. 2015 Dec7;8:3665-78.

41、Joan Massagué. TGFβ in Cancer .Cell. 2008 Jul 25;134(2): 215–230.

42、Dong S,et al. Everolimus synergizes with gefitinib innon-small-cell lung cancer cell lines resistant to epidermal growth factorreceptor tyrosine kinase inhibitors. Cancer Chemother Pharmacol. 2012Nov;70(5):707-16.

43、Fei SJ,et al. Targeting mTOR to overcome epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitor resistance in non-small celllung cancer cells. PLoS One. 2013 Jul 16;8(7):e69104.

44、Ruth Nussinov,et al. The structural basis for cancertreatment decisions.Oncotarget. 2014 Sep; 5(17): 7285–7302.

45、Li S, Chen S,et al. Synergistic interaction between MEKinhibitor and gefitinib in EGFR-TKI-resistant human lung cancer cells. OncolLett. 2015 Oct;10(4):2652-2656. Epub 2015 Aug 6.

46、Gao SP,et al. Mutations in the EGFR kinase domainmediate STAT3 activation via IL-6 production in human lung adenocarcinomas. JClin Invest. 2007 Dec;117(12):3846-56.

47、Gao SP,Chang Q,et al. JAK2 inhibition sensitizesresistant EGFR-mutant lung adenocarcinoma to tyrosine kinase inhibitors. SciSignal. 2016 Mar 29;9(421):ra33.

48、Tracey J Mitchell,et al. Signal transducer andactivator of transcription (STAT) signalling and T-cell lymphomas. Immunology.2005 Mar; 114(3): 301–312.

49、Xu ZH,et al. RAF1-MEK1-ERK/AKT axis may confer NSCLCcell lines resistance to erlotinib. Int J Clin Exp Pathol. 2013 Jul 15;6(8):1493-504.Print 2013.

50、Wan J, Wu W. Hyperthermia induced HIF-1a expression of lung cancer through AKTand ERK signaling pathways. J Exp Clin Cancer Res. 2016 Jul 26;35(1):119.

51、Anthony W. Tolcher, Anti-tumour activity in RAS-driventumours by blocking AKT and MEK. Clin Cancer Res. 2015 February 15; 21(4):739–748.

52、Ren H,et al. Blockade efficacy of MEK/ERK-dependentautophagy enhances PI3K/Akt inhibitor NVP-BKM120"s therapeutic effectiveness inlung cancer cells. Oncotarget. 2016 Oct 11;7(41):67277-67287.

53、Coco S,et al. Afatinib resistance in non-small celllung cancer involves the PI3K/AKT and MAPK/ERK signalling pathways andepithelial-to-mesenchymal transition. Target Oncol. 2015 Sep;10(3):393-404.

54、Ochi N,et al. Src mediates ERK reactivation ingefitinib resistance in non-small cell lung cancer. Exp Cell Res. 2014 Mar10;322(1):168-77.

55、Filosto S,et al. Src mediates cigarette smoke-inducedresistance to tyrosine kinase inhibitors in NSCLC cells. Mol Cancer Ther. 2013Aug;12(8):1579-90.

56、Yoshida T,et al. Tyrosine phosphoproteomics identifiesboth codrivers and cotargeting strategies for T790M-related EGFR-TKI resistance in non-small celllung cancer. Clin Cancer Res. 2014 Aug 1;20(15):4059-4074.

57、Jeffrey D. Bjorge,et al. Simultaneous siRNA Targetingof Src and Downstream Signaling Molecules Inhibit Tumor Formation andMetastasis of a Human Model Breast Cancer Cell Line. PLoS One. 2011; 6(4):e19309.

58、Ross A Okimoto,et al. AXL receptor tyrosine kinase as atherapeutic target in NSCLC. Lung Cancer (Auckl). 2015; 6: 27–34.

59、Wu Z,et al. Coexpression of receptor tyrosine kinaseAXL and EGFR in human primary lung adenocarcinomas. Hum Pathol. 2015Dec;46(12):1935-44.

60、Zhang Z,et al. Activation of the AXL kinase causesresistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer. Nat Genet. 2012 Jul1;44(8):852-60. doi: 10.1038/ng.2330.

61、Brand TM,et al. AXL mediates resistance to cetuximabtherapy. Cancer Res. 2014 Sep 15;74(18):5152-64.

Wu F,et al. Therole of Axl in drug resistance and epithelial-to-mesenchymal transition ofnon-small cell lung carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 2014 Sep15;7(10):6653-61..

62、Tian Y,et al. Anexelekto (AXL) Increases Resistance toEGFR-TKI and Activation of AKT and ERK1/2 inNon-Small Cell Lung Cancer Cells. Oncol Res. 2016;24(5):295-303.

63、Takezawa K,et al. HER2 amplification: a potentialmechanism of acquired resistance to EGFR inhibition in EGFR-mutant lung cancersthat lack the second-site EGFRT790Mmutation. Cancer Discov. 2012 Oct;2(10):922-33.

64、Ling Li,et al. Acquisition of EGFR TKI resistance andEMT phenotype is linked with activation of IGF1R/NF-κB pathway in EGFR-mutantNSCLC. Oncotarget. 2017 Nov 3; 8(54): 92240–92253.

65、Peled N,et al. Insulin-like growth factor-1 receptor(IGF-1R) as a biomarker for resistance to the tyrosine kinase inhibitorgefitinib in non-small cell lung cancer. Cell Oncol (Dordr). 2013Jul;36(4):277-88.

66、Zhou J,et al. Implication of epithelial-mesenchymaltransition in IGF1R-induced resistance to EGFR-TKIs in advanced non-small celllung cancer. Oncotarget. 2015 Dec 29;6(42):44332-45.

67、Idoroenyi Amanam,et al. Targeted Therapies forPancreatic Cancer. Cancers (Basel).2018 Feb; 10(2): 36.

68、Shi X,et al. Genetic alterations and protein expressionin combined small cell lung cancers and small cell lung cancers arising fromlung adenocarcinomas after therapy with tyrosine kinase inhibitors. Oncotarget.2016 Jun 7;7(23):34240-9.

69、Matthew J. Niederst,et al. RB loss in resistant EGFRmutant lung adenocarcinomas that transform to small-cell lung cancer. NatCommun. 2015 Mar 11; 6: 6377.

70、Watanabe S,et al. Transformation to small-cell lungcancer following treatment with EGFR tyrosine kinase inhibitors in a patientwith lung adenocarcinoma. Lung Cancer. 2013 Nov;82(2):370-2.

71、Zou Q,et al. The relationship between BIM deletionpolymorphism and clinical significance of epidermal growth factorreceptor-mutated non-small cell lung cancer patients with epidermal growthfactor receptor-tyrosine kinase inhibitor therapy: a meta-analysis. Transl LungCancer Res. 2015 Dec;4(6):792-6.

72、Tabara K,et al. Loss of activating EGFR mutant genecontributes to acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors in lungcancer cells. PLoS One. 2012;7(7):e41017.

73、Bidkhori G,et al. Modeling of tumor progression inNSCLC and intrinsic resistance to TKI in loss of PTEN expression. PLoS One.2012;7(10):e48004.

74、Shien K,et al. Acquired resistance to EGFR inhibitorsis associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancercells. Cancer Res. 2013 May 15;73(10):3051-61.

75、Yingjiao Xue,et al. Protein Cell. 2017 Mar; 8(3):178–190.

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