聊一點單細胞免疫分析
分析單個白細胞可以幫助科學家確定它們在對抗疾病方面的具體作用。圖片版權：Thomas Deerinck / SPL
人體免疫系統是一支龐大而分散的軍隊。這數十億特殊細胞在不停運動，要確定哪些細胞在特定的地方或情況下做什麼，是非常困難的。但蛋白質組學和基因組學技術的進步，使得研究人員逐漸開始能夠對這些細胞進行分類。這是一項大規模的事業，可能產生比人類基因組計劃多1000億倍的數據。數十年來，免疫學家一直非常依賴流式細胞術，這種技術涉及用不同熒游標記物標記細胞。在過去八到九年里，使用金屬離子標記細胞的高通量質譜流式技術為癌症、肺結核和瘧疾等疾病的免疫應答提供了更為詳細的視角。然而這些技術幾乎不能完全覆蓋所有的表面受體標記，很難確定T細胞和B細胞的具體工作機制。這些T細胞和B細胞表面獨特的蛋白質分子被稱為T細胞受體和B細胞受體，這些受體是人體精心設計的「識別特定靶點並以進化方式對它們做出響應」，紐約 Memorial Sloan Kettering Cancer Center 分子生物學家Jennifer Sims說。她還說道，免疫細胞幾乎與人類一樣多樣化。這些表面受體識別病原體或腫瘤上的特定分子特徵或抗原。當受體檢測到有害抗原時，它會觸發免疫細胞增殖和發動攻擊。每種受體都是不同的，由基因片段的組合編碼，隨著免疫細胞發育，這些基因片段被混洗並重組。上個月，在伊利諾斯州芝加哥舉行的美國癌症研究協會年會上，Sims主持了一場關於分析T細胞受體庫方法 的會議，他們認為，參與抗病的免疫，在一生中可以產生多達10E20個獨特的受體。試圖找出免疫系統中數以萬億的T細胞受體和B細胞受體中的哪一部分與人類某種疾病相關，看起來是不可能的任務。但專門的測序方法使得研究人員能夠在一定程度上進行嘗試。目前約有60家公司提供服務或試劑盒，用於從細胞樣本中讀出T細胞和B細胞受體的重組基因序列。通過統計這些序列並觀察它們如何改變，研究人員可以追蹤哪些細胞克隆在疾病中起關鍵作用。有些公司提供了整套解決方案，研究人員可以給該公司大量冷凍組織，他們會進行DNA分離、純化，或提取RNA樣本，並進行分析分析，將確定的核苷酸序列及其比例返回用戶。而另一些公司則銷售多重PCR引物，研究人員可以使用這些引物，自己動手，從他們自己的樣品中擴增T細胞和B細胞受體基因片段。這兩種解決方案各有優缺點。有的適合冷凍組織，有的適合福爾馬林固定、石蠟包埋的樣本，有些對腫瘤細胞DNA的干擾敏感。所有平台都有一個共同的挑戰：難以區分真正的生物學變化，例如免疫應答過程中某些細胞的小量擴增，以及使用酶引起的技術錯誤。通過研究這些受體及其B細胞類似物，研究人員希望了解疾病過程中免疫系統如何響應和演變。儘管流式細胞儀可以揭示不同細胞群體如何上升和下降的粗略細節，但免疫受體分析方法可以確定所涉及的B細胞和T細胞「克隆」。劍橋麻省理工學院（MIT）的化學物理學家Alex Shalek說，為了研究這些特殊的受體並進一步擴大單細胞分析的能力，一系列基於測序的方法在這一領域掀起了一陣漣漪。正如DNA的四個"字母"可以編碼人體內的任何基因一樣，使用獨特的DNA片段標記抗體為實驗研究理論上無限多的蛋白質鋪平了道路，Shalek說。此外，這些技術通過允許研究人員在同一個細胞中測量轉錄組 - 也就是完整的表達基因集，豐富了免疫分析。雖然它不如大規模流式細胞術，但是可以在任何實驗室、醫院或診所用DNA測序儀完成基於測序的免疫分析，這可能會擴大該技術的應用範圍。研究人員現在可以選擇至少六種商業系統和自己動手的方法，將單個細胞中的RNA和蛋白質轉換成可在標準DNA測序儀上讀取的字母串。Sims說，這些新技術漸漸地加深了科學家對疾病狀態下各種不同免疫細胞如何在微環境中發揮作用的理解。流式細胞術幾十年來一直是免疫學的主要技術手段，但它有缺點，就是可用標記少，存在光譜之間的重疊，對於涉及少量細胞或複雜表型的分析來說比較困難。2009年，當時在加拿大多倫多大學的化學家Scott Tanner提出了一種解決方案：質譜流式（通常稱為CyTOF），該方法將流式細胞術與質譜法結合，使用金屬綴合的抗體將可檢測標記的數量提高至50個左右。這項技術在遺傳學家Garry Nolan及其加州斯坦福大學的同事用它在人類骨髓細胞中同時測量34個參數後得到了普及，質譜流式幫助他們可同時追蹤各種免疫細胞對不同藥物的反應。質譜流式是發現新事物或新功能的好工具，不過在維護和使用上比較複雜，一旦質譜流式揭示哪些細胞和分子需要關注，還是需要採用常規流式細胞儀進行證明和後續分析。常規流式細胞術更快：每秒最多可以處理10,000個以上細胞，而質譜流式只能處理大約1,000個細胞。 由於質譜每個樣品使用更多的抗體，所以任何錯誤都是十分昂貴的。如果您在分析後仍然需要收集細胞，質譜流式則不適合，因為細胞是被打散分解的。
最後，流式中文網總結一下，常規流式儘管單兵作戰能力不足，但結合目前的質譜、DNA測序等技術，可以更好地揭示免疫系統的奧秘，並且最終的成果應用於臨床，還是常規流式更靠譜。
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