玻片功能化進行靶向細胞分離

最新 06-09

每期一個小視頻，給您呈現醫學手術前沿。

早上好，小夥伴們，今天小編繼續為大家帶來最前沿最科學的實驗技術。本期實驗的總目標是為了溫和的捕獲以及分離所用到的細胞。

這項技術的優點：

1）篩選出表明耐藥性的細胞生物標誌物；

2）完全可自定義為任何感興趣的細胞類型；

（一）APTES與DSB功能化

實驗步驟：

1. 首先，在氧氣等離子機上清洗玻璃表面五分鐘，準備2.5毫升2%重組(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(或者APTES)溶液。將 50 ul 的 APTES 和2.45 毫升的乙醇混合在圓錐管中。將APTES溶液移到玻璃表面,然後覆蓋表面, 並把它們放在一個震蕩平台上，室溫放置50分鐘, 使之均勻分布成APTES層。同時預熱烘箱到55攝氏度（8孔板和24孔板），或者90攝氏度玻（璃器皿）。

2. 將板子從震蕩平台中取出後,使用乙醇沖洗玻璃表面。用100%氮氣,乾燥表面。然後把8孔板和24孔板放在烘箱中放置2小時, 或者把玻璃器皿放在烤箱里1小時。

3. 準備2.5毫升的脫硫生物素或DSB緩衝液，在37.5ul的二甲基亞碸中混合1.5mg/ml DSB。並添加5mg/ml EDC到 2462.5 ul的 0.1 摩爾的MES緩衝液中，pH 值為6，然後混合這兩種溶劑。

4. 15分鐘之後加入1ulBME以結束DSB與EDC之間的反應，從烘箱中取出熱的 APTES 功能化玻璃表面, 讓它們冷卻5到10分鐘。在玻璃表面添加 MES 緩衝器, 用70度角的吸管將其沖洗乾淨, 這樣, 尖端就不會直接指向表面。

5. 從固定點 (如孔邊緣) 排出並吸出緩衝液, 使用MAS緩衝液沖洗2次，將DSB溶液應用到玻璃表面，將它們轉移到培養皿的濕紙巾上，蓋上蓋子。並在冰箱中孵育18到24小時。

（二）鏈親和素功能化

實驗步驟：

在4攝氏度下孵育之後，用PBS去沖洗玻璃表面3次。然後稀釋親和素或者SAV儲存液到0.4mg/ml，並且均勻地應用它到玻璃表面, 以形成一個稀薄的塗層。在將玻璃孵育18到24小時後, 使用 150 ul 的 PBS 沖洗每個表面三次。然後用去離子水弄濕紙巾, 並把它橫插放在板子周圍的一個14厘米的培養皿，以保留板孔的水分。將培養皿懸放在玻璃表面, 並將其放置在4攝氏度的生物安全級別為1級的冰箱中, 直到需要為止。

（三）細胞捕獲及釋放

操作過程：

1.從含有細胞的T175培養瓶中吸取培養基，然後用PBS沖洗細胞並吸走緩衝液。加上10ml的無酶的懸液如細胞解離溶液到培養瓶中，然後在37攝氏度中孵育6分鐘。6分鐘之後，加入10ml的冷的HBSS去稀釋懸液。然後用移液槍吸20ul的細胞並用紅細胞計數板去計數。

2. 將細胞懸液離心，500G，4度，5分鐘，並用HBSS重懸細胞到1x10^6/ml。上下吹打溶液重懸細胞並減少細胞氣泡的產生以避免降低抗體的結合。

3. 然後將細胞懸液分成單獨的對照組以及實驗組。在各自的細胞溶液中加入生物素化的抗體，並在4攝氏度中來回顛倒混勻孵育30分鐘。用150ul的HBSS去沖洗在一個12板子的功能化玻璃化的玻璃器皿三次。

4. 將細胞懸液加入到孔中並在冰上的振蕩器上孵育45分鐘。同時，準備一個含20mM生物素的無菌的HBSS緩衝液。在孵育之後，輕柔的用150ul的HBSS去沖洗玻璃器皿中的細胞溶液。在重複沖洗不少於兩次之後，加入150ul的生物素溶液到每個各自的釋放孔，並孵育20分鐘使反應進行。

實驗結果：MCF7GFP 和原巨噬細胞的功能化細胞捕獲

在這個實驗中，MCF7GFP暴露於功能化玻璃表面，使用HLA ABC抗體，60%的細胞被捕獲。在暴露於20mM生物素下，80% 的被捕獲細胞被分離。