使用單細胞多組學探索TNBC病人的新輔助化療療效

Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing

背景

TNBC是最惡性的乳腺癌，目前通行治療策略是新輔助化療，但是會有30%–50%的TNBC病人抵抗，因為腫瘤異質性，很大的一個疑問是化療耐受後的腫瘤裡面的突變是之前就存在呢還是治療途中產生的。

TNBC的異質性一直是熱點，主要有3種研究策略：

Deep-sequencing studies (Balko et al., 2012, Balko et al., 2014, Shah et al., 2012)

multi-region sequencinganalysis (Yates et al., 2015)

single-cell sequencing studies (Gao et al., 2016, Navin et al., 2011, Wang et al., 2014)

化療耐受後的腫瘤裡面的突變是之前就存在呢還是治療途中產生的這個研究在各種癌症裡面有數據，結論不一致。

acquired resistance (Ding et al., 2012, Kim et al., 2015, Kolodziejczyk et al., 2015, Patch et al., 2015)

adaptive resistance (Ding et al., 2012, Kurtova et al., 2015)

數據有：

In acute myeloid leukemia, whole-genome sequencing identified different modes of clonal evolution, with some patients acquiring relapse-specific mutations and others selecting minor clones (Ding et al., 2012).

In high-grade serous ovarian cancer, platinum-based chemotherapy induced new somatic mutations, consistent with acquired resistance (Patch et al., 2015), while resistance to cytotoxic chemotherapy in bladder cancer was associated with the selection of pre-existing subpopulations (Kurtova et al., 2015).

In glioblastoma, treatment with temozolomide induced many new mutations in post-treatment tumor samples, consistent with an acquired model of therapy resistance (Kim et al., 2015, Kolodziejczyk et al., 2015).

實驗設計

作者們一開始的實驗設計就很清晰，知道自己要做什麼，就是為了探索為什麼同樣的TNBC病人會對新輔助化療產生不同的反應呢？化療耐受後的腫瘤裡面的突變是之前就存在呢還是治療途中產生的？

整體實驗設計如下，每個步驟的數據分析也都很清晰，更重要的是作者的數據分析結果完美的解釋和回答了他們之前的假設。

腫瘤外顯子測序

包括20 TNBC病人的bulk WES測序數據，blood的對照以及新輔助化療前後腫瘤，還有部分治療中的腫瘤測序數據。

走的是腫瘤外顯子的標準分析流程，20 TNBC病人恰好是10個新輔助化療受益，10個抵抗。

下面是10個新輔助化療受益，腫瘤消失的病人

可以看到下面的10個病人的化療之前的WES數據裡面的很多somatic mutation都在化療後取樣的WES數據裡面找不到了：

可以看到下面的10個病人的化療之前的WES數據裡面也是有很多somatic mutation都在化療後取樣的WES數據裡面找不到了，但同時有很多突變在化療前沒有，但是在化療後卻出現了！！！

高深度測序解決突變是否存在於化療前

因為作者採用的bulk的腫瘤外顯子測序平均測序深度是188X，認為對somatic mutation來說，置信度仍然不高，所以採取了高深度測序，來探索那些新輔助化療耐受的病人化療後新出現的 somatic mutation是因為在化療前的腫瘤WES裡面由於測序深度(腫瘤克隆比例極低)不夠導致沒有被發現呢，還是本身就之前沒有，而是化療誘導產生的。

值得注意的突變，作者也單獨列出來了：

單細胞DNA測序

測序是：single-nucleus sequencing (SNS) (Gao et al., 2016, Navin et al., 2011) on 900 single cells from matched longitudinal samples of 8 TNBC patients，包括：

four clonalextinctionpatients (P1, P2, P6, P9)

four clonalpersistencepatients (P11, P12, P14, P15)

使用FACS挑選細胞，全基因組測序，深度0.1X即可，只探索CNV信息。

對於那些新輔助化療受益的病人來說，很明顯化療前後的單細胞DNA測序數據的CNV可以把它們清晰的分開，化療前的細胞有著癌細胞的特性，但是化療後的基本上都是正常細胞。

對於那些新輔助化療抵抗的病人來說，同一個病人的化療前後的單細胞都表現為癌細胞的特性，而且有著不同的克隆，說明了這些病人在化療的過程中癌症有著一定程度的進化，產生了新的突變。

作者在2016年就做過 sequenced 1,000 single cells from tumors in 12 patients with TNBC ，數據是： SRP064210 for tumors T1–T10 and SRA018951 for tumors T11 and T12 , 也是根據CNV信息看克隆結構。

單細胞轉錄組測序

測序方法是：a high-throughput nanogrid single-nucleus RNA-sequencing (SNRS) method (Gao et al., 2017). 納入的病人是：

3,370 single nuclei isolated from two matched longitudinal samples per patient from the four clonal extinction patients (P1, P2, P6, P9).

performed SNRS on ～400 nuclei from each matched time-point per clonal persistence patients (P11, P12, P14, P15)

還利用了作者 Nat. Commun, 8 (2017) , 文章裡面的240 diploid normal breast cells作為單細胞轉錄組CNV分析的對照，數據也是在GEO， SRP095350

每個病人的細胞個數如下：

對於那些新輔助化療受益的病人來說，從單細胞轉錄組的CNV信息很清楚的可以看到他們治療後癌細胞含量極低了。