文獻解讀：多能幹細胞和衍生心肌細胞circRNA特徵分析

Signature of circular RNAs in humaninduced pluripotent stem cells and derivedcardiomyocytes

人類誘導多能幹細胞和衍生心肌細胞circRNA特徵

期刊：Stem Cell Research & Therapy影響因子：4.211

發文單位：蘇州大學附屬第一醫院心血管研究所

1 摘要

背景：circular RNAs（circRNAs）是一類新的非編碼RNA調控分子。雖然通過RNAseq技術及生物信息分析發現了大量的circRNAs，但對組織及疾病特異性的circRNAs研究還很少，不足以推動 circRNA在基礎研究及臨床實踐上的應用。本研究的目的是研究人類誘導多能幹細胞human induced pluripotent stem cells (簡稱hiPSCs) 和多能幹細胞衍生心肌細胞hiPSC derived cardiomyocytes (簡稱hiPSC-CMs)，鑒定心臟或疾病特異性的circRNAs。

方法：成纖維細胞產生hiPSCs，進而用RPMI+B27培養基激活WNT通路分化成hiPSC-CMs，而後進行高通量測序，使用CIRCexplorer軟體進行circRNA的鑒定和定量。並對circRNA及其來源基因進行整合分析以了解兩者的關係。使用qPCR對心臟及疾病特異性的circRNAs進行確認。

結果：本研究在hiPSCs和hiPSC-CMs中，共鑒定到5602個circRNAs，第一次發現，分化的心肌細胞中circRNAs的豐富度要高於未分化的hiPSCs細胞。除了來源基因依賴的表達，整合分析還發現了許多非來源基因依賴的circRNA表達。circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2在心肌分化和人胎兒心臟中呈現選擇性表達。circSLC8A1在擴張型心肌病病人的心臟組織中異常高表達。

結論：hiPSC-CMs circRNAs表達豐富，心臟特異性的circRNAs比如circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2或可作為hiPSC-CMs標誌物。檢測異常高表達circSLC8A1或可作為診斷心臟疾病病理狀態的一個方法。

2 材料方法

1 人組織收集

本研究使用的捐獻成人及胎兒組織，已獲得蘇州大學和華中科技大學倫理委員會批准。在正常人身上獲得正常心臟組織，在擴張型心肌病心臟移植病人處獲得心臟疾病組織。胎兒的組織比如腦，心臟，肝，脊柱，胃從懷孕9-10周的流產兒身上獲得，並徵得病人的同意。

2 成纖維細胞分離和hiPSCs細胞誘導

皮膚活組織切碎，使用膠原酶IV(Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA)在Dulbecco』s modified Eagle medium (DMEM; Gibco)培養基上37℃消化6h。尼龍網過濾，用PBS沖洗成纖維細胞，然後在DMEM培養基上培養，培養基加入10% 胎牛血清(FBS; Gibco)，37℃，潮濕，5%CO2環境中培養。成纖維細胞長到不超過5代時，將細胞塗抹到包被凝膠及胎牛血清DMEM培養基中，然後使用編碼4個幹細胞因子(OCT4, SOX2, KLF4 and cMYC) 的慢病毒顆粒轉染。5天後轉染的細胞轉移至輻射過的MEF飼養層，並在KSR培養基上培養（DMEM/F12 supplemented with 20% KnockOut Serum Replacement, 4 ng/ml bFGF, 2 mM L-glutamine, 1% MEMnon essential amino acids, and 0.007% 2-mercaptoethanol）。20-30天後，採集ESC-like的單克隆細胞，並培養在基質膠包被的E8培養基上。

3 hiPSCs分化成心肌細胞

hiPSCs單層定向分化成心肌細胞按照之前報道的方法，並做了一些小的修改。具體步驟參見原文。

4 hiPSCs和hiPSC-CMs的鑒定。

通過embryoid body（EB），畸胎瘤成型，以及幹細胞標誌物（OCT4, NANOG, TRA-1-60）免疫熒光染色來證實hiPSC的多能性。hiPSC-CMs則通過形態學分析、鈣瞬變、和心肌細胞標誌物（TNNT2,α-SA）免疫熒光染色判斷。

5 RNA測序

用RNeasy kit (Qiagen,CA, USA), DNase I (Qiagen) 提取hiPSCs和hiPSC-CMs total RNA。用Ovation?RNA-Seq System V2 (NuGEN, CA, USA)構建RNA測序文庫，用NEBNext? DNA Library Prep Master Mix Set for Illumina?構建barcode文庫，切除回收250bp片段，HiSeq2000平台雙端測序，平均深度在30 百萬reads。測序序列先使用TopHat 2.1比對到人參考基因組GRCh37/hg19。提取未能完全比對的reads，使用TopHat-Fusion再次比對到參考基因組。同一序列兩部分能夠比對到相同的染色體，提取非同一方向的reads，作為候選反向剪接reads（back-spliced junction reads）。反向剪接reads重新比對到資料庫有注釋的基因，準確判斷每個剪接事件準確的供體和受體位點。最後剪接reads使用RPB（reads per billion mapped reads, 包括TopHat比對and TopHat-Fusion比對）定量。

6 GO分析

使用Metascape(http://metascape.org)做GO富集分析。

7 siRNA轉染knockdown QKI基因

針對QKI基因設計合成了三種類型的siRNAs，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉染hiPSC-CMs，兩種對hiPSC-CMs QKI基因抑制顯著，用於後續分析。

8 RT-PCR 和 qPCR

用PrimeScript reverse transcriptase reagent kit (TaKaRa, Dalian, China)進行RNA的反轉錄，發散性引物擴增circRNA轉錄本，凝膠電泳進行擴增片段可視化。引物如Additional file 1: Table S1。PCR產物用Sanger測序驗證。用SYBR Premix Ex Taq kit (TaKaRa)，在StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems?, CA, USA)進行qPCR定量。樣品三個重複，qPCR定量時三重複。數據用18S rRNA校正，2-ΔΔCT分析。

9統計分析

使用Student』s t test or one-way ANOVA對qPCR的結果進行統計分析。p

3 結果

1 鑒定hiPSCs和hiPSC-CMs circRNAs

使用慢病毒介導的4過表達轉錄因子（OCT4, KLF4, c-MYC and SOX2），誘導成纖維細胞重編程為hiPSCs。分離的hiPSCs細胞在E8培養基上培養(Fig. 1a)，並進一步使用多潛能幹細胞標誌物NANOG, SOX2, OCT4 and TRA-1-60（Fig. 1b and Additional file 2: Figure S1A），擬胚體，（Additional file 2:Figure S1B），畸胎瘤成型（Fig.1c, d）驗證。hiPSCs進一步激活WNT通路誘導成心肌細胞，早期中胚層標誌物基因（BRA），心臟中胚層標誌物基因（MESP1），心臟特異性前體基因（TBX5）和結構基因（TNNT2, MYH6 and MYH7）均在hiPSC-CMs分化時呈現階段特異性表達（Additional file 2:Figure S1C–H）。高表達的心臟標誌基因如TNNT2、sarcomeric α-actinin 如Fig. 1e，及典型的鈣瞬變（Fig. 1f）。這些數據均說明成功的誘導hiPSCs分化為hiPSC-CMs。

提取hiPSC，hiPSC-CMs（傳30代）total RNA用於RNAseq，提取測序reads中反向剪接的reads，使用CIRCexplorer（默認參數）進行reads的注釋，定量。只有樣品中該連接點reads覆蓋數量≥2，才會繼續用於後續分析。用RPB (reads per billion mapped reads)對表達量進行標準化。一共鑒定到5602個circRNAs, hiPSC組中有1612個，hiPSC-CMs組中有4260個，270個交集共同存在。另外，超過3500個circRNA不在circBase資料庫中（Fig. 2a）。hiPSC，hiPSC-CMs分別有614, 2918個novel circRNAs，說明circRNAs在這兩種細胞中是特異性存在的。所有鑒定到的circRNAs在Additional file 4: Table S2。

我們研究了circRNA的基因組特徵。大部分的host gene能夠產生1-7個circRNA轉錄本，多circRNAs的host gene數量少於少circRNA的host gene數量（Fig. 2b）。相比hiPSC， hiPSC-CMs能產生更多的circRNA轉錄本（Fig. 2b）。比如TTN基因我們共鑒定到129個不同的轉錄本，這個基因有非常多的外顯子，而且能編碼很多條紋肌相關的蛋白（Additional file 4:Table S2）。 然而多能幹細胞基因如OCT4 and NANOG並未檢測到circRNAs。大部分circRNAs的長度在200-2500bp之間（Fig. 2c），基因組的整體長度不超過45kb（Fig. 2d）。外顯子的數量在1-8個（Fig. 2e），單外顯子circRNAs外顯子的長度要遠長於多外顯子circRNAs的平均外顯子長度（Fig. 2f）。

2 circRNAs在hiPSC-CMs 高丰度表達

正如Fig. 2a看到的，相比hiPSC，hiPSC-CMs能產生更多的circRNA轉錄本。因此，我們計算了circRNAs reads與所有匹配reads的比例。hiPSC-CMs，hiPSC circRNA的reads數量佔比是17.5% vs 6% (Fig. 3a)。所有結果均顯示hiPSC-CMs中的circRNA的豐富度要比hiPSC高的多。數據同時顯示兩個表達量上升的重要的剪接因子Quaking (QKI) and RNA binding Motif protein 20 (RBM20)與circRNA的形成有關。qPCR進行驗證兩個基因表達量(Fig. 3c)。

top 100 circRNAs熱圖(Fig. 3d)顯示circRNAs在hiPSC，hiPSC-CMs呈現特異性表達。相比hiPSC，hiPSC-CMs大部分circRNAs呈現高表達，只有很少一部分是下調的。進一步用發散引物進行RT-PCR擴增環狀轉錄本驗證這些差異表達的circRNAs。hiPSC-CMs 6個編碼基因(SLC8A1, ARID1A, FNDC3B, CACNA1D, SPHKAP and ALPK2)產生circRNAs的外顯子表達量更高，相比hESC and hiPSC組，hiPSC-CMs和成纖維細胞circAASS, circFIRRE and circTMEFF1的表達量明顯下調(Fig. 3e) 與測序得到的結果一致。circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2或許可以成為心肌細胞分子標誌物。

為了進一步驗證這些分子標誌物，我們提取心肌細胞不同分化時期的total RNA進行RT-PCR分析（Fig. 3f）。circALPK2在第4天時有高表達，而circSLC8A1, circCACNA1D and circSPHKAP在9,15,30天高表達。儘管一直存在表達，circFNDC3B轉錄本依然從第9天開始明顯上升。隨後，我們對擴增片段進行Sanger測序（Fig. 3g and Additional file 5: Figure S2）。以上結果提示circSLC8A1, circCACNA1D and circSPHKAP或可成hESCs or hiPSCs分化為心肌細胞時新的分子標誌物。

然後我們進一步研究剪接因子Quaking在hiPSC-CMs circRNA表達時的功能。如Fig. 3h, i，用siRNA抑制QKI的表達後，circRNAs 包括 circSLC8A1, circFNDC3B, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2的表達量顯著下調。結果說明hiPSC-CMs circRNAs豐富表達或許剪接因子如QKI的表達量增加有關。

3 circRNA與來源基因表達整合分析

由於circRNA來源於親本轉錄本外顯子的反向剪接而成，我們對circRNA與來源基因的表達，做了相關性分析。首先分析hiPSC，hiPSC-CMs中線性轉錄本，基於閾值50 RPKM，一共鑒定到1270個基因的表達量超過兩倍(Additional file 6: Figure S3A, Additional file 7: Table S3)。多潛能基因如NANOG, SOX2 and OCT4下調，而結構基因編碼的心臟終端分化肌相關的蛋白包括TNNT2, MYL2, MYH6, and MYH7顯著上升。hiPSC上調基因GO分析主要富集到cell cycle, transcriptional regulation of PSCs, DNA replication and chromatin remodeling at the centromere (Additional file 6: Figure S3C, E)。而hiPSC-CMs上調的基因主要涉及到heart development, muscle system process, striated muscle cell differentiation等(Additional file 6: Figure S3D, F)。這些分析的結果也說明了數據的可靠性。

接下來，我們對hiPSCs and hiPSC-CMs top100 circRNAs及其線性親本RNA的相關性分析顯示，兩者表現出強烈的正相關性（Fig. 4a, b）。為了挑選獨立於基因表達的circRNAs，我們計算了每個基因環狀轉錄本與線性轉錄本的比例（Fig. 4c, d）。大部分circRNA所佔的比例是50%。設置閾值75%，我們發現有一些circRNAs的表達與其線性RNA的表達模式並不一致。相比於hiPSC，hiPSC-CMs組更多circRNA表現出非來源基因依賴的表達。Additional file 8: Table S4是表達丰度高且來源基因依賴的circRNAs表達列表。

對差異表達circRNAs的來源基因進行GO分析，如Fig. 4e, f。hiPSCs and hiPSC-CMs表達豐富的circRNAs來源基因均與covalent chromatin modification, cell cycle and cell morphogenesis等相關，不過子分類不太相同。而hiPSC-CMs上調的circRNAs來源基因富集到myocardial function（心肌功能），如heart development, membrane trafficking（跨膜運輸）, organelle assembly（細胞器組裝）, fiber organization（纖維組織）and muscle structure development (Fig. 4f)。而hiPSC特異性的circRNAs的來源基因富集到一些通路如DNA metabolic process, DNA replication等 (Fig. 4e)。

4 人健康及疾病心臟中差異表達的circRNA

為了找到更可靠的心臟circRNAs, 人類正常心臟中鑒定到6075個circRNAs（以前文獻）， 我們在hiPSC-CMs中鑒定到4260個circRNAs。如Fig. 5a所示，兩者交集共有897個circRNAs（Additional file 9: Table S5）。有許多hiPSC-CMs或其他組織特異性的circRNAs，可能是不同階段的hiPSC-CMs，或組織異質性引起的。circSLC8A1, circFNDC3B, circSPHKAP and circALPK2包含在897個重疊的circRNAs中，而circCACNA1D僅在我們的數據中鑒定到。

我們研究了人胎兒組織 中這5個circRNAs的表達。4個circRNA(circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2)在心臟組織中高表達(Fig. 5b-e)，circFNDC3B的改變不明顯(Fig. 5f )。

為了評估使用circRNAs作為心臟疾病標誌物的可行性，qPCR比較正常人心臟與DCM病人心臟circRNAs表達水平。眾所周知的一個心肌病分子標誌物，natriuretic peptide B (NPPB)在DCM病人心臟中的表達量顯著高於正常心臟(Additional file 10: Figure S4A)。在5個circRNAs中，只有circSLC8A1顯著升高(Fig. 6 and Additional file 10: Figure S4)。

我們推測circSLC8A1的上調依賴於其線性轉錄本的升高。為了驗證假設，使用特殊的引物qPCR定量線性轉錄本，與我們的推斷一致，SLC8A1線性轉錄本的表達量也顯著增加(Fig. 6d)。值得注意的是circSLC8A1改變的倍數要比其線性轉錄本改變的倍數高的多(Fig. 6a, d),這或許是因為circRNA更穩定。儘管CACNA1D線性轉錄本的表達量顯著降低，但circCACNA1D的表達確不明顯(Fig. 6b, e)。這與我們之前得到的circCACNA1D與來源基因獨立表達的結果一致(Additional file 8: Table S4)。

除了環狀RNA，SPHKAP, ALPK2 and FNDC3B的mRNA沒有觀察到顯著的差異(Fig. 6 and Additional file 10: Figure S4)。

4 討論

多能幹細胞包括ESCs and iPSCs，在心臟疾病幹細胞治療上有很大希望。但我們對心臟發育和心肌分化機制了解還很有限，對於尋找高效的方法產生人源心肌細胞是個大障礙。新出現的心臟特異性的circRNAs提示circRNAs或與心臟發育有關，並可以作為心肌細胞和心臟疾病的分子標誌物。這個假設促使我們對iPSCs 和 hiPSC-CMs的circRNA和mRNA表達譜進行研究。本研究，我們一共鑒定到5602個circRNAs。大部分的circRNAs呈現iPSCs或hiPSC-CMs細胞特異性的表達。接下來的研究展示了許多高丰度表達的心臟circRNAs, 如circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2。另外，相比正常心臟，circSLC8A1在DCM病人心臟中顯著高表達。

我們發現hiPSC-CMs許多高表達的circRNAs來源於心臟相關的基因，涉及到heart development, membrane trafficking and muscle structure development，同樣在存在於與hESC-derived CMs。hiPSC-CMs and hESCCMs表達最豐富的一個circRNA是由Solute Carrier Family 8 Member A1 (SLC8A1)的第一個外顯子環化而成，這個基因是心肌膜上的一個Na(+)-Ca(2+)交換器，能夠在應激收縮時排出Ca(2+)。儘管大部分的circRNAs表現為gene依賴的表達，我們依然發現一些circRNAs與其線性的mRNAs表達呈較差的相關性。或許是因為環化後RNA的穩定性或獨特的形成機制。我們的分析顯示，這類circRNAs在hiPSC-CMs中比例更高。

本研究的一個關鍵發現是circRNA在分化hiPSC-CMs表達更豐富而非幹細胞如hiPSCs。hiPSCs僅鑒定到一小部分back-splicing reads，大約只佔總比對reads的6%。而在hiPSC-CMs中，這一比例增加到17.5%。同樣，近期的一些研究發現，分化的神經和動物的腦中circRNAs表達更為豐富。而在增殖的結腸癌細胞和神經膠質瘤中，circRNA相比於正常組織不那麼豐富。這些數據說明分化的細胞能夠激活許多基因促使circRNA的形成或者穩定性。此前，報道兩種RNA結合蛋白能夠調控circRNA的環化。QKI是一個剪接因子能夠通過結合在兩端的內含子區誘導外顯子的環化。RNA binding Motif protein 20 (RBM20), 其缺失可引起DCM，有報道他對於TTN轉錄本的1-band區域的環狀是極為重要的。通過RNAseq和qPCR，我們發現RBM20心臟特異性表達，以及QKI的顯著升高。下調hiPSC-CMs QKI，能夠降低circSLC8A1, circFNDC3B, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2 的表達，說明QKI在circRNA產生時發揮重要作用。而其他能夠激活circRNA表達的調控因子的發現，仍待更多的研究。

穩定性、靈敏性和特異性是分子標誌物的重要特徵。以往研究顯示相比線性RNA，circRNAs能夠抵抗核酸酶降解而具有更長的半衰期。結合Tan et al.』s 研究及我們的數據顯示hESC-derived and hiPSC-derived CMs細胞特異性circRNA表達如circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2。進一步分析發現這4個分子有選擇性的在胎兒心臟中高表達。因此，心臟特異性circRNAs或可成為心肌細胞可選的分子標誌物。

許多circRNAs具有成為特殊癌症疾病或CD28-related CD8(+) T-cell ageing分子標誌物的潛能。Du et al.發現circFOXO3在高齡病人和小鼠心臟高表達，能夠結合胞質抗衰老和抗壓蛋白而促進衰老。本研究發現，circSLC8A1在DCM病人顯著增加。Tan et al.』s study 顯示circSLC8A1在心臟疾病如DCM, HCM and IHD呈現上升的趨勢，雖缺乏統計意義。Tan et al.』s study 缺乏統計意義，或是因樣本量限制，或是對照組受到其他因素的影響。最近，Siede et al. 也報道circSLC8A1在DCM活檢組織高表達。本研究顯示circSLC8A1與其線性轉錄本表達呈正相關。circSLC8A1的變化倍數更高，顯示其環狀的形式要比線性形式更穩定。綜合來看，circSLC8A1或可作為心臟疾病病理狀態的標誌物。同時也需要更多的研究探討circSLC8A1與其他心臟疾病的關係。健康個體及心臟病人血液circRNA表達譜研究有助於鑒定循環circRNA標誌物以用於臨床診斷。

5 結論

本研究展示了分化心肌細胞中豐富表達的circRNA, 鑒定了許多非基因依賴的circRNAs，也得到許多心臟特異性的circRNAs，包括circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2, 這些或可成為分子標誌物。另外，circSLC8A1的異常表達與心臟疾病密切相關。需要更多的研究揭示circRNA在心臟發育，心血管疾病中作用，並研究病人的血液以鑒定新的circRNA分子標誌物。

6 研究思路整理

研究材料：hiPSCs、hiPSC-CMs細胞用於RNAseq，心臟組織及胎兒組織用於qPCR驗證。

研究方法：

1 成纖維細胞誘導成hiPSCs，進而誘導成hiPSC-CMs，並用一系列的小實驗證明誘導出來的細胞是合格的。

2 RNA測序，本研究選用兩個細胞（沒做重複），進行rRNA去除建庫（此種方法可提供mRNA, lncRNA, circRNA的信息），HiSeq2000測序，CIRCexplorer軟體鑒定circRNA，RPB（reads per billion mapped reads）數據標準化，使用倍數計算差異（沒有重複樣品，不考慮P-value）。

3 使用Metascape(http://metascape.org)做GO富集分析。

4 siRNA轉染knockdown QKI基因，qPCR驗證其對circRNA的影響。

5 RT-PCR 和 qPCR。

6 使用Student』s t test or one-way ANOVA對qPCR的結果進行統計分析。p

結果展示：

1 確定誘導的hiPSCs、hiPSC-CMs可靠性：hiPSCs細胞培養（Fig. 1a），NANOG, SOX2, OCT4 and TRA-1-60免疫熒光（Fig. 1b and Additional file 2: Figure S1A），擬胚體，（Additional file 2:Figure S1B），畸胎瘤成型（Fig.1c, d），心臟標記物BRA、MESP1、TBX5、TNNT2, MYH6 and MYH7 qPCR定量柱狀圖（Additional file 2:Figure S1C-H），TNNT2、sarcomeric α-actinin （Fig. 1e），鈣瞬變（Fig. 1f）。

2 circRNA特徵：新circRNA數量venn圖（Fig. 2a），鑒定結果列表（Additional file 4: Table S2），基因產生circRNA數量分布柱狀圖（Fig. 2b），circRNA長度分布（Fig. 2c），基因組長度分布（Fig. 2d），外顯子數量分布（Fig. 2e），單外顯子長度分布（Fig. 2f）。

3 差異分析：hiPSC-CMs，hiPSC circRNA的reads數量比較柱狀圖（Fig. 3a），QKI、RBM20測序表達量柱狀圖 （Fig. 3b），qPCR驗證柱狀圖 （Fig. 3c），top100 circRNAs熱圖（Fig. 3d），circAASS, circFIRRE and circTMEFF1等電泳圖驗證表達量差異（Fig. 3e），心肌細胞不同分化時期circRNA表達變化，電泳圖展示（Fig. 3f），Sanger測序驗證成環點（Fig. 3g and Additional file 5: Figure S2），QKI抑制後qPCR定量柱狀圖（Fig. 3h），及其影響的circRNA qPCR定量柱狀圖（Fig. 3i）。

4 circRNA與其來源基因分析：來源基因差異熱圖（Additional file 6: Figure S3A），列表（Additional file 7: Table S3），hiPSC上調基因GO富集柱狀圖、網路圖（Additional file 6: Figure S3C, E），hiPSC-CMs上調的基因GO富集柱狀圖、網路圖（Additional file 6: Figure S3D, F），circRNA與來源基因相關性峰圖（Fig. 4a, b），（Fig. 4c, d），hiPSC-CMs上調的circRNAs來源基因GO分析 （Fig. 4f），hiPSC上調的circRNAs來源基因GO分析（Fig. 4e）。

5 健康人與疾病比較：本研究與文獻報道circRNA venn圖（Fig. 5a），交集表（Additional file 9: Table S5），胎兒組織4個circRNA qPCR柱狀圖（Fig. 5b-f），DCM病人與正常人 circRNA比較qPCR定量（Fig. 6 and Additional file 10: Figure S4），幾個circRNA線性轉錄本與circRNA轉錄本 qPCR定量比較（Fig. 6 and Additional file 10: Figure S4）。

李紀偉丨翻譯

趙 燦丨審核

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