中科院武漢病毒所肖庚富組在四級病原胡寧病毒的治療性單抗方面取得進展

近日，抗病毒藥物專業雜誌Antiviral Research(抗病毒研究)在線發表了病毒學國家重點實驗室肖庚富研究組的最新研究成果，論文題為 「Novel neutralizing monoclonal antibodies against Junin virus」(針對胡寧病毒的新型中和單抗)。該研究獲得了針對四級病原胡寧病毒（Junin virus, JUNV）的一系列中和單抗，其中命名為J99的單抗可在體外以0.78 μg/ml的作用濃度抑制50%病毒的感染（IC50=0.78 μg/ml），有望在體內發揮治療作用。

JUNV是沙粒病毒科哺乳動物沙粒病毒屬中的重要成員，是生物安全四級病原。其主要流行於南美洲，可導致阿根廷出血熱，致死率約為30%，僅次於埃博拉、馬爾堡等烈性病毒。近年來，隨著國際人員和物資的快速流通，JUNV有向北美洲、歐洲和亞洲蔓延的趨勢，對全球的生物安全形勢造成了威脅。

JUNV天然宿主為野鼠，在其體內癥狀較輕或無癥狀。人類在工作和生活中接觸攜帶病毒的野鼠、或其分泌物及排泄物、被其污染的食物和帶有病毒的氣溶膠等而被感染。一部分人（約35%）在感染後的1-2周內，癥狀逐漸加重，表現出持續發熱、脫水、腎功能不全、低血壓、多處粘膜部位嚴重出血、神經紊亂、休克等癥狀，最終死於大出血和昏迷。儘管在阿根廷地區已批准使用活病毒疫苗（Candid#1）來預防JUNV的感染，但目前仍無針對性藥物用於臨床治療阿根廷出血熱。因此，研製針對JUNV的藥物，尤其是治療性抗體，顯得十分重要。

與同科病毒拉沙病毒類似地，JUNV基因組包含一個長約7.2k的大片段L和一個長約3.5k的小片段S。L片段編碼基質蛋白Z和RNA聚合酶L，而S片段則編碼核蛋白NP（nucleoprotein）和包膜糖蛋白GPC（glycoprotein precursor）。NP蛋白和L蛋白、Z蛋白在病毒的生命周期中所行使的功能分別為基因複製和轉錄、出芽並組成病毒的衣殼基質蛋白。GPC則由穩定信號肽（stable signal peptide, SSP）、介導病毒與受體吸附的包膜糖蛋白1（glycoprotein 1, GP1）和介導膜融合的包膜糖蛋白2（glycoprotein 2, GP2）三部分組成。沙粒病毒的GPC在成熟後組裝形成了一個典型的GPC三聚體結構展示在病毒粒子表面，介導病毒與受體的吸附以及吸附後的膜融合過程。因GPC（SSP、GP1、GP2）在病毒進入細胞的過程中發揮至關重要的作用，常被作為進入抑制類藥物開發的靶點。

較為特別的是，肖庚富團隊獲得的這些單抗是研究人員通過對小鼠進行DNA免疫，並通過傳統雜交瘤融合和篩選得到。具體為：首先將JUNV包膜糖蛋白GPC全長基因克隆至真核表達載體；隨後通過肌肉注射加電擊的方式將質粒導入小鼠體內，實現原位表達和免疫；通過傳統鼠雜交瘤方式分離脾細胞並培養；最後採用過表達GPC的細胞ELISA來篩選單克隆細胞株和抗體。在此基礎上，研究人員通過對分離出來的15株單抗性質進行表徵，發現其中5株單抗具有較好中和效果，此結果分別在帶有熒光素酶報告基因和GFP報告基因的VSV假病毒上得到驗證。且其作用機理均為封閉GP1蛋白，阻止病毒與受體結合，抑制病毒進入細胞。其中，位於GP1 loop 3 上的Tyr122和Asp123被認為是中和抗體與病毒作用的關鍵位點。

圖1 五株單抗中和效果

圖2 單抗中和表位及關鍵作用位點

該項工作獲得的針對胡寧病毒的治療性單抗作為藥物儲備，將為阿根廷出血熱的防治提供候選藥物；建立的獲取針對沙粒病毒單抗的方法作為技術儲備，將為獲取更多類似病毒的單抗提供理論支撐。

作者簡介：肖庚富，博士，研究員。病毒學國家重點實驗室副主任，中國科學院「百人計劃」入選者。先後於1989、1992、1999年獲同濟醫科大學醫學學士、醫學碩士、武漢大學理學博士學位。曾任武漢大學生命科學學院教授、博士生導師、院長助理。2006年入選教育部「新世紀優秀人才」支持計劃，2008年入選中國科學院「百人計劃」。現任中國科學院武漢病毒研究所研究員、副所長，病毒生物化學學科組組長。在重要醫學病毒膜蛋白介導病毒進入細胞的分子機制及抑製藥物（Entry inhibitor）、新概念疫苗設計、蛋白質構象病研究領域具有紮實的工作積累。主持國家重大科學研究計劃、973、國家自然科學基金等多項課題。2004年以來發表SCI論文50餘篇，代表性論文：Lancet（柳葉刀）.2004. 363(9413): 938-47; J Biol Chem. 2007. 282(1):381-9; Autophagy.2011.7(2):205- 16；J Virol.2011. 85(13):6252-62; Antiviral Res. 2014.104:7-14; J Virol. 2015. 89(10):5668-86。

Highlights

Monoclonal antibodies were obtained based on DNA immunization and intact GPC screening.

Five monoclonal antibodies effectively neutralize Junin virus.

The neutralizing antibodies blocks Tyr122 and Asp123 in loop 3 of GP1.

Abstract

Junin virus (JUNV) is the pathogen of Argentine haemorrhagic fever which results in high lethality, while there is limited therapeutics available. Here, a series of mouse monoclonal antibodies (mAbs) were isolated through immunization with DNA and screening against glycoprotein complex (GPC). Finally, five mAbs were found to effectively neutralize JUNV. Further research indicated that they were capable of binding conformational GPC and strongly binding glycoprotein 1 which is responsible for receptor recognition. Epitope mapping revealed that they targeted loop 3 of GP1, and Tyr122 and Asp123 in loop 3 were identified as their common binding sites, which may account for their neutralizing activity. This study presents a new strategy for developing neutralizing antibodies against JUNV and provides therapeutic candidates for protection against JUNV infection.

來源：病毒學國家重點實驗室

本期編輯：Tony

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