量子點抗體偶聯
量子點( Quantum Dots，QDs)是近20年發展起來的一種半導體熒光納米材料，具有優良的光譜特徵和光化學穩定性。與生物熒光染料相比，其激發譜線範圍寬、發射譜線窄、發光效率高、發光顏色可調、光穩定性好，十分適合作為熒游標記物。用其作為標記物，可以顯著降低檢測方法的檢出限，從而提高分析方法的靈敏度和解析度。
量子點的合成方法主要分為物理方法和化學方法。
物理方法一般是通過光刻、激光燒蝕法等超微細加工技術，減小固體的維度和尺寸來製備量子點。物理方法可保證所合成材料的純潔性，但是對儀器設備要求較高，受到加工工藝的限制因而應用較少。
化學方法設備簡單、製備過程中可控性好、量子點純度高，因而成為主流的方法，其主要途徑為有機相製備和水相製備。有機體系多採用有機金屬法，即在高沸點的有機溶劑中利用前軀體熱解製備量子點，合成的量子點類型包括單核、核殼式和多元混晶等。該體系產物具有熒光量子產率高、熒光半峰窄、單分散性和穩定性好等優點，但試劑毒性強、生物相容性不好。水相製備則是在水中利用各種穩定劑直接合成量子點，具有無毒、廉價、操作簡單、生物相容性好等優點。但是大部分水相製備的量子點發光性能較差，通常需要經過如選擇性沉澱、水熱法和輔助微波法等手段提高熒光量子產率。
近十餘年來，通過優化製備條件和工藝，量子點的光學性能和生物相容性有了很大的改善，量子點逐漸在生物標記、生物感測和生物成像以及多個領域的檢測與診斷的研究中得到關注和應用。
量子點作為生物熒光探針標記細胞是表面受體成像最理想的熒光探針;也能夠如取代酶標抗體或可充當熒游標記物應用於免疫分析、快速診斷中。
量子點作為熒光探針使用時，其表面需要修飾生物分子，如抗體、多肽、糖類等。如何將生物分子有效的偶聯在量子點表面並保持其生物活性，是量子點生物學應用中極為關鍵的一步。到目前為止，已經有一些類型的偶聯技術在量子點抗體偶聯中應用。
1.非共價結合方法
1.1 親和素系統
生物素-親和素系統( Biotin-avidin system，BAS)以生物素和親和素具有的獨特結合特性為基礎，結合二者即可偶聯抗原抗體等大分子生物活性物質。親和素與生物素間的親和力極強，它們的結合迅速、專一、穩定，並具有多級放大效應。生物素標記抗體和酶的標記率高，又不影響蛋白的活性。基於生物素-親和素的非共價結合反應也應用於量子點抗體偶聯中，抗體在偶聯反應前需要先生物素化。該系統條件下進行的偶聯沒有位點特異性，是親和素化的量子點與整個抗體分子之間進行的非共價結合。
1.2雙功能銜接器/蛋白A 系統
雙功能銜接器Mattoussi等人首次將銜接器蛋白應用於IgG抗體偶聯中，該反應基於靜電吸引作用。銜接器蛋白同時具有亮氨酸拉鏈結構域和G蛋白結構域，其中亮氨酸拉鏈結構域帶有正電荷，可以與量子點( CdSe /ZnS)靜電結合，G蛋白結構域則可結合抗體的Fc區域。應用該種「雙功能」銜接器進行偶聯時，抗體的Fc末端和量子點表面接合，其抗原結合靶點F( ab")2結構域則朝外。
組氨酸標籤的肽和抗體可以使用鎳-氨三乙酸( Ni-NTA)結構作為雙功能銜接器用於量子點偶聯。在該反應中，氨三乙酸基團通過共價作用和量子點表面結合，鎳離子與組氨酸標籤的抗體則通過螯合作用結合。同生物素-親和素結合相比較，這種組氨酸標籤的方法有諸多優點:可以控制配體結合的方向(組氨酸標籤可以很方便結合於蛋白或肽的特定位點)、探針尺寸緊湊，生產成本較低。
蛋白A可作為銜接蛋白用於抗體和量子點的偶聯。蛋白A是在葡萄球菌細胞壁上發現的一種表面蛋白，該蛋白可以通過與Fc片段的相互作用結合於免疫球蛋白表面。蛋白A與谷胱甘肽包被量子點表面的羧基進行反應，抗體再與蛋白A結合。各種不同類型的抗體通過該種非共價偶聯的方式很容易的結合在量子點表面。到目前為止，已經有使用包含有蛋白A，蛋白G等IgG結合結構域的銜接蛋白用於抗體和量子點之間的偶聯的報道。研究人員通過該偶聯方式將KPL-4人乳腺癌細胞的表面抗體與量子點( CdSe /CdZnS)相連接，進行活細胞成像的研究。熒光相關光譜儀和原子力顯微鏡的測試結果顯示，蛋白A偶聯量子點的粒徑小於10 nm，它們在水溶液中是單分散顆粒，在PBS中可以穩定2個月以上。蛋白A/G為媒介的抗體偶聯有一個突出的優點，即可以控制抗體朝外面向抗原結合位點，所以和量子點偶聯後抗體的活性不會發生改變。
2.共價結合
2.1氨基和羧基共價結合
最常用的共價結合方法是使用零長度交聯劑乙基-3-［3-二甲基氨基丙基］碳化二亞胺鹽酸化物( EDC)將抗體和量子點直接偶聯在一起。在該反應中，首先用N-羥基硫代琥珀醯亞胺( NHS)將量子點表面的羧基活化，在EDC的作用下，活化的羧基和抗體表面的原始氨基形成醯胺鍵。氨基和羧基共價結合反應最大的優點在於大部分蛋白都包含有原始的氨基和羧基，在進行量子點偶聯之前不需要進行化學修飾;但是在該偶聯反應中存在一種可能，即抗原的抗體結合位點被結合在抗體Fab片段附近的氨基酸非特異性封閉。因此，EDC介導的抗體與量子點的偶聯反應可能會導致較低的量子產量和偶聯產物的聚集。
2.2氨基和巰基共價結合
為了避免抗體結合位點的非特異性吸附，琥珀醯亞胺基4-［N-馬來醯亞胺甲基］環己烷-1-羧化物( SMCC)偶聯反應被用於抗體和量子點的偶聯。在SMCC的偶聯反應中，二硫蘇糖醇( DTT)活化抗體產生巰基( Fc片段)，巰基和QDs-SMCC表面的順丁烯二醯亞胺基結合。在該方法中，二硫鍵結合在兩個重鏈組成的鉸鏈區，能夠選擇性的粘附以構建兩個抗體片段，每個片段都包含有自由的巰基和一個抗原結合位點。在氨基和巰基的共價反應中，通過將PEG偶聯於量子點表面可以改善其穩定性和水溶性。氨基酸結尾的PEG500通過EDC和量子點( CdSe /ZnS)偶聯，接著兩個長鏈的雙功能交聯劑sulfo-LCSPDP，sulfo-SMCC分別活化抗體和量子點，進行氨基和巰基的共價反應偶聯抗體和量子點。相對地說，自由可利用的巰基基團在天然生物大分子中很少存在，而且由於氧化作用通常不是很穩定。因此在氨基和巰基的共價反應中，巰基多是由二巰基乙醇或DTT還原抗體片段生成的。
2.3醛基和醯肼共價結合
QDs與抗體共價結合所進行的交聯反應通常基於氨基和羧基(馬來醯亞胺催化)、氨基和巰基、或者醛基和醯肼功能基團。通過氧化作用將抗體Fc片段的碳水基團活化為醛基，醛基可以與量子點共價結合。很多免疫球蛋白分子是糖蛋白，可以通過高碘酸鹽氧化構建醛基。多克隆IgG分子Fc片段有糖基，該基團可以完全從抗原結合位點移出，以保證通過糖鏈進行偶聯反應。這時高碘酸鹽氧化的抗體可以與醯肼基團反應。羧基化的量子點可以通過ADH修飾以在表面產生醯肼，醯肼進而和氧化的抗體通過醛基-醯肼的共價化學反應偶聯。由於抗體表面碳水化合物位點是已知的，該方法可以控制量子點-抗體結合的比率。不同的量子點-抗體偶聯方法的特點進行了比較。
量子點作為一種新型的半導體熒光材料，擁有卓越的光學性能和良好的生物相容性。從第一次獲得量子點到現在的20年來，人們通過不斷優化反應條件(保護劑、pH、反應溫度、前驅體、物質量之比等)、改進現有製備技術(水熱法、微波輔助法)以及創新量子點結構(殼核式、混晶量子點)，有效改善了量子點的光學性能和生物相容性，使得量子點作為熒光探針在生物分析應用中開始嶄露頭角。隨著生物分子與量子點偶聯技術的不斷進步，量子點從細胞標記等應用已逐漸開始向多個領域的檢測與診斷方向滲透，其作為熒游標記物已經開始在生物分析尤其在免疫分析、快速診斷中廣泛應用。目前在食品安全，某些疾病的診斷方面都進行了一定的積累。
有效地將生物分子偶聯在量子點表面並保持其生物學活性，是量子點生物學應用中至關重要的一步。生物分子與量子點偶聯的最大挑戰在於偶聯後水溶性的降低、量子產量、偶聯產物的穩定性，以及由於納米粒子空間排列所伴隨的生物分子親和力的降低。人們通過對量子點進行改性，修飾PEG長鏈等方法，使這些問題得到了一定程序的改善。進一步提高量子點抗體偶聯產物的水溶性、穩定性等也是未來量子點生物應用的重要研究方向之一。目前已見報道的量子點為基礎的定量免疫檢測方法較少，這主要是由於缺少有效的程序進行量子點的生物偶聯純化和表徵。隨著表徵儀器的發展以及偶聯、純化和檢測方法的不斷改進，以量子點為基礎的定量免疫檢測方法將得到飛速的發展。
參考資料：
Nat Mater. 2005 Jun;4(6):435-46.
Nat Protoc. 2007;2(5):1152-65.
Send to ACS Macro Lett. 2015 Jun16;4(6):645-650. Epub 2015 Jun 2.
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