生物等效性研究中離群值的一般考慮
生物等效性研究（Bioequivalence，BE）是評價同一藥物不同製劑間差異及仿製葯與原研製劑間可替換性的重要方法。近年來，我國生物等效性研究質量得到了很大程度的提升，但近期提交的申報資料中陸續出現不合理剔除「離群值」等的問題，如何對這些新問題做出科學合理的評價是我們審評當前階段面臨的新的挑戰。
一、離群值的判定
生物等效性研究中，離群值通常為一個或多個血葯濃度測定值或葯代動力學（Pharmacokinetics，PK）參數與研究中其他受試者相應結果明顯不一致的數據。
如在血葯濃度檢測過程中有時會出現一個或多個濃度點遠遠高於或低於前後濃度點的情況，即通常所說的「跳點」。
PK參數異常主要表現為一個或多個受試者服用某一製劑（受試製劑或參比製劑）後的葯時曲線下面積（Area under the curve，AUC）或最大血葯濃度（Cmax）與另一周期或其他受試者的結果相比差異較大。
離群值的出現可能是製劑質量不均一、試驗過程中出現方案偏離或樣本檢測時的操作失誤等原因造成的。但是，由於離群值是在樣本檢測完成、甚至是統計分析完成後發現的，也可能存在研究者主觀判定因素。
二、出現離群值的原因
1. 製劑質量問題
試驗所用製劑可能存在批內或批間均一性差的情況，例如，受試者服用某種緩釋製劑而產生不尋常的高或者低的響應，這種離群值的出現可能是由於緩釋製劑質量不均一，導致在某個或某些受試者出現劑量突釋或由於包被因素阻止藥物的溶解而產生製劑釋放異常。
2. 方案偏離導致的離群值
由於試驗過程中受試者有意吐葯等行為，可能導致受試者未服藥或服藥劑量偏低，或服藥後由於製劑本身存在的不良反應發生嘔吐或嚴重腹瀉，導致藥物暴露量減少，從而產生離群值。
檢測時由於個別樣本處理或分析檢測過程中發生方案偏離或出現失誤，導致待測物最終檢測結果不準確，也可能產生離群值。
3. 受試者與製劑相互作用
可能在少數個體中由於受試者和製劑的相互作用，導致這些個體對兩種製劑的相對生物利用度與多數群體相比明顯不同，儘管這兩種製劑可能在大多數個體中是生物等效的，但對於這些少數個體來說，這兩種製劑並不顯示生物等效性[1]。
三、對離群值的一般考慮
1. 基本考慮
雖然目前用於判定離群值的統計學方法有很多，但是即使在統計學驗證的基礎上，也不能簡單地認為某個結果被判定為離群值就可以直接剔除。因為不合理剔除離群值可能會導致原來不等效的結果變成等效，從而使研究結論為生物等效的製劑存在潛在不等效風險。
我國發布的《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[2]嚴格規定，對於生物等效性研究，通常不能接受由於葯動學理由重新分析試驗樣品。同樣地，FDA《生物等效性統計學指導原則》中要求[1]，在製劑失敗的情況下，受試製劑或參比製劑都有可能會出現離群值。但是，就亞群而言，即使在參比製劑上觀察到不尋常的響應，仍然可能會擔心兩種製劑缺乏可替換性。特別是對於非重複設計試驗，通常不建議基於上述原因剔除離群值。使用重複的交叉設計，設計的重新測試特徵應該能對是否刪除離群值起到指示作用。
若認為某個數據點為離群值，其原因應該具有統計上的說服力，並且如果可能的話，應在方案中預先規定。
EMA《關於生物等效性研究的指導原則》[3]中要求，僅僅基於統計學分析和葯代動力學原因剔除數據是不被允許的，因為不可能將製劑效應與其他影響葯代動力學的影響因素區分開來。
2. 特殊情況
離群值可能是由於意外事件，如技術缺陷引起的，如發生此類特殊情況，申請人應該提供足夠的科學證據來證明。EMA《關於生物等效性研究的指導原則》[3]中對於幾種特殊情況的處理方式作了較為具體的規定。
（1）服用參比製劑的受試者缺乏任何可測濃度或只有非常低的血漿濃度。如果AUC小於參比製劑AUC幾何均值的5％（應排除離群值受試者的數據），則認為受試者具有非常低的血漿濃度。基於此原因排除數據只會在特殊情況下被接受，並且審評可能對試驗的有效性提出質疑。
（2）受試者的基線濃度非零且> 5％Cmax，這些數據應從生物等效性計算中剔除。
EMA一份關於氨氯地平/纈沙坦的審評報告中[4]，監管機構接受了由於上述第一種情況而剔除受試者的研究結果。
3. 再給葯研究
某些情況下，申請人懷疑受試者服藥時出現方案偏離，希望通過對存在離群值的受試者重新給葯，並重新進行血樣採集和血葯濃度檢測，以證實剔除離群值的合理性。FDA認為，如果再給葯研究包括可疑受試者和一定比例的來自首次BE研究的受試者作為對照，且受試者的例數應能使再給葯研究具有一定的把握度，則可以通過再給葯的方式來證明特殊原因引起的離群值。若可疑受試者在再給葯研究中顯示正常響應，則可以證實在首次BE研究中響應確實異常，並接受從原BE研究中剔除離群值。
EMA對再給葯研究則有不同的認識。在OVERVIEW OF COMMENTS RECEIVED ON DRAFT GUIDELINE ON THE INVESTIGATION OF BIOEQUIVALENCE[5]中顯示，某些情況下，經葯代動力學分析後會發現一些響應異常的血漿樣本，即使在整個臨床試驗中並沒有報道過任何的事件，也會存在受試者未吞咽藥品的可能。在這種情況下，應該可以進行重新給葯研究，以證明初始研究的離群值，並根據重新給葯研究的結果從評價中剔除該受試者。但對於以上建議，EMA最終得出的結論為：目前暫不支持再給葯研究，因為某個結果在重新給葯時未重現並不意味著這個結果是不真實的。EMA並不期望每次都會有同樣的結果。任何側重於將具有較大差異的結果作為排斥目標的方法都會增加錯誤地顯示等效性的可能[5]。這與我國指導原則中通常不能接受由於葯動學理由重新分析試驗樣品的規定是一致的。
四、不合理剔除現象舉例
審評過程中發現，目前申報資料中存在一些不合理剔除數據的現象，以某種不恰當的理由剔除主觀上認為不合理的數據，從而達到試驗結果符合生物等效性標準的目的。
如：某BE研究報告中受試製劑和參比製劑Cmax幾何均值之比的90%置信區間為96.2%~124.3%，但研究以某受試者試驗過程中（葯後4小時）出現低血糖服用了巧克力為由，剔除了該例受試者（Tmax為3小時）的全部數據，將該受試者數據重新納入生物等效性統計分析，結果顯示，兩製劑Cmax幾何均值之比的90%置信區間為99.7%~126.7%，顯然兩製劑存在不等效風險。
另一BE研究報告中以某受試者試驗結束後尿液紅細胞一個「+」為由，未將該受試者數據納入BE分析集，AUC和Cmax均符合生物等效標準。但審評發現，該受試者篩選期就出現了尿液紅細胞一個「+」，卻未將其剔除，該受試者完成了全部試驗。將該受試者數據重新納入並進行生物等效性分析，結果顯示，受試製劑和參比製劑AUC幾何均值之比的90%置信區間為76.4%~114.1%，因此審評不能接受兩製劑生物等效的結論。
五、結語
對於生物等效性研究中的離群值應當非常謹慎，如果製劑可能本身並不等效，不排除存在申請人主觀地選擇和排除潛在離群值從而改變生物等效性結論的可能。
通常情況下，生物等效性研究中不建議剔除離群值。對某些特殊情況下可能真實存在的離群值予以認可，並不意味著可以隨意基於葯動學原因剔除數據。不合理剔除離群值，使原本不等效的製劑得出相反的結論，可能給公眾用藥安全帶來極大風險。
申請人應在開展生物等效性研究前進行充分的製劑研究，確保製劑質量均一、可控，試驗過程中應嚴格控制試驗質量，把控好每一個細節，盡量避免試驗偏離，才能在根本上避免離群值的出現，確保試驗數據的可靠性。
參考文獻:
[1] Statistical Approaches to Establishing Bioequivalence. https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm070244.pdf. January 2001.
[2] 《9012 生物樣品定量分析方法驗證指導原則》. 中國藥典2015年版. 363-368.
[3] GUIDELINE ON THE INVESTIGATION OF BIOEQUIVALENCE. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2010/01/WC500070039.pdf. 01/08/2010.
[4] Assessment report Amlodipine/Valsartan Mylan. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Public_assessment_report/human/004037/WC500204384.pdf. 28 January 2016.
[5] OVERVIEW OF COMMENTS RECEIVED ON DRAFT GUIDELINE ON THE INVESTIGATION OF BIOEQUIVALENCE CPMP/EWP/QWP/1401/98 REV. 1. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Other/2010/02/WC500073572.pdf. 10/02/2010
（統計與臨床藥理學部供稿）
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