《自然醫學》雙重磅：CRISPR曝重大漏洞！被成功編輯的細胞或缺失抑癌基因p53，具有潛在致癌能力｜科學大發現

本周《自然醫學》雜誌上又發表了兩篇與CRISPR技術相關的論文，暴露了尚未成熟的CRISPR/Cas9技術可能存在的一個關鍵缺陷！24小時之內，多家CRISPR基因編輯公司股價暴跌10%以上！

這兩項研究分別來自瑞典卡洛林斯卡研究所[1]和劍橋諾華生物醫學研究院[2]，兩個團隊分別獨立發現，CRISPR/Cas9基因編輯過程中造成的DNA雙鏈斷裂，實際上可以激活p53蛋白通路。該蛋白在基因修復過程中有關鍵作用，一定程度上導致了基因編輯的失敗。這也意味著，基因編輯成功的細胞，往往具有p53缺陷——這也是癌細胞中最常見的基因突變！

換句話說，基因編輯成功的細胞很可能是潛在的癌細胞，利用CRISPR/Cas9進行臨床治療可能會無意中增加患癌症的風險！

CRISPR/Cas9可以說是發展得彷彿坐了火箭，這項技術首次走入人們眼帘還是在2012年，但是第一項臨床試驗去年就已經在中國進行了。技術走得太快，就必然存在一些尚未被發現的缺陷。

CRISPR/Cas9技術在應用過程中有個奇怪的現象，它在轉化細胞（例如癌細胞）上編輯效率很高，副作用也很小；但是在治療疾病方面具有極高潛能的人多能幹細胞（hPSC）上，效率卻咋也提不起來。與其他細胞類型相比，hPSC的基因修飾效率只有五到二十分之一[3-7]。

面對基因修飾，hPSC簡直頑強到底，「寧死不從」[8-13]。

為了找出這其中的關鍵，劍橋諾華生物醫學研究院研究者們開發了一種幹細胞系，這種細胞在特定條件下表達Cas9蛋白，只需慢病毒轉染gRNA就能實現插入特定基因序列。

這種方法的編輯效率很高，超過80%的細胞都轉入了目標序列，但是更慘烈的是，絕大多數細胞都沒能熬過這個過程，只有極少數的hPSC存活了下來。

CRISPR/Cas9過後，滿地殘留著細胞碎片，這個CRISPR/Cas9有毒啊……

基因插入效率是很高，可是細胞也很受傷啊

研究者想到，是不是轉入的gRNA種類太多，一次編輯好幾個位點細胞受不了呢？以前也有研究顯示編輯多個位點是對細胞損傷很大的。於是這次他們固定選擇了一種不耽誤細胞生存的基因，重複了上述實驗，然而結果也是類似的。

對照組的細胞不涉及DNA鏈的斷裂，就能好好生存好好擴增，而接受了基因插入的細胞真是慘烈極了，只有少部分尚能活蹦亂跳，大部分都沒能熬過改造。

可見單個位點的DNA雙鏈斷裂，就足以對hPSC產生致死的毒性了！

正常的細胞生長曲線和被「毒害」的細胞

為了探究這個過程中的關鍵分子通路，研究者們對表達變化較大的基因進行了篩選，最終發現最關鍵的人物竟然是我們都很熟悉的老朋友p53！進一步摸索，下游的通路則是與p21有關。確實，p53本身也在DNA損傷修復過程中起到了很大的作用[14]，對能修復的損傷就修復，修復不了就讓細胞自殺。

研究者嘗試在細胞系中敲除p53基因，不出所料，p53缺陷的hPSC馬上就對基因編輯表示馴服，不再拚死抵抗，生存率大大增加了。另一方面，在兩個不同的幹細胞系中，敲除p53使基因編輯的效率分別增加了19倍和16倍！

雖然還是有細胞頂不住壓力，但是敲除了p53之後明顯皮實多了

在另一項研究中，卡洛林斯卡研究所研究者在視網膜色素上皮（RPE）細胞中進行了類似的研究，同樣發現CRISPR/Cas9基因編輯導致的DNA雙鏈斷裂會激活p53-p21通路，誘導細胞周期的停滯，導致基因編輯的失敗。

除此之外，研究者還發現，在DNA雙鏈被成功切斷之後，Cas9蛋白還會在切斷位點停留6個小時之久[18]，這很可能耽誤了正常的DNA損傷修復，加劇了DNA雙鏈斷裂帶來的影響。

作者之一的Emma Happaniemi在採訪中說，「挑選成功完成受損基因修復的細胞，我們很可能無意中挑選到p53缺陷的細胞。」「如果移植到患者體內，比如說在治療遺傳疾病的場景下，這些細胞很可能會引發癌症，導致人們對CRISPR基因治療安全性的擔憂。」[15]

這兩篇論文一出，市場為之震動。目前已經走在臨床前沿的CRISPR Therapeutics股價暴跌13%——這已經是上周被FDA叫停臨床試驗之後短期內第二次下跌了——其他基因編輯公司也受到了不小的影響，Editas Therapeutics、Intellia Therapeutics股價均有10%左右的下跌。[16]

CRISPR Therapeutics首席執行官Sam Kulkarni表示，該研究結果可信，雖然研究內容實際並不能覆蓋所有的CRISPR使用情景。另一位因利益關係不願透露姓名的科學家則表示十分擔心，很多CRISPR導致的致命缺陷可能「已被錯過」。[17]

看起來CRISPR/Cas9和p53之間的矛盾是不可調和的。要麼p53不在，細胞有癌變風險；要麼p53在，基因編輯失敗和細胞自毀二選一。

但是這並不意味著CRISPR技術走進了死胡同。

卡洛林斯卡研究所的生化學家Bernhard Schmierer表示，這些都是十分早期的研究，只是「初步成果」，「目前還不清楚這些發現是否可以影響到臨床實際使用的細胞。」此前在實驗室中進行的研究，從未發現CRISPR導致的癌症，也一定程度上說明了問題。

而且研究關注點在於CRISPR/Cas9技術，在此之外，還有Cpf1等諸多頗具希望的Cas酶，這些酶是否會出現同樣的p53困境還未可知。研究者也認為，如果只是剪除致病基因，而不涉及新基因的插入的話，p53是不會被「調動"的.

再說了，這個問題並不是完全沒有辦法解決。在現有的技術條件下，我們可以對編輯前後的細胞進行測序，監控p53功能，規避風險。

研究者們正在努力尋找p53通路的詳細作用過程，如果可以在基因編輯過程中讓p53暫時歇一歇，那豈不是美哉？而且在某些情況下，我們還有不需切斷DNA的單鹼基編輯技術，還是大有可為滴。

來自肯特大學的遺傳學家Darren Griffin教授有句話說得很好，「幾乎任何能夠帶來益處的治療方法，都有能力造成傷害，這些發現應當被放在更大的背景中去思考。」 [19]

技術前行總會遇到瓶頸，而每一次挫折都將使讓我們更加強大。

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參考資料：

[1] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0049-z

[2] https://www.nature.com/articles/s41591-018-0050-6

[3]Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339,823–826 (2013).

[4]Hsu, P. D. et al. DNA targeting specifcity of RNA-guided Cas9 nucleases.Nat. Biotechnol. 31, 827–832 (2013).

[5]He, X. et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Res. 44, e85 (2016).

[6] Lombardo, A. et al. Gene editing in human stem cells using zinc fnger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol.25, 1298–1306 (2007).

[7]Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K. & Doudna, J. A. Enhanced homologydirected human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife 3, e04766 (2014).

[8] Zwaka, T. P. & Tomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 21, 319–321 (2003).

[9] Hockemeyer, D. et al. Efcient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-fnger nucleases. Nat. Biotechnol. 27,851–857 (2009).

[10]Liu, Y. & Rao, M. Gene targeting in human pluripotent stem cells. Methods Mol. Biol. 767, 355–367 (2011).

[11] Hockemeyer, D. & Jaenisch, R. Induced pluripotent stem cells meet genome editing. Cell Stem Cell 18, 573–586 (2016).

[12] Song, H., Chung, S. K. & Xu, Y. Modeling disease in human ESCs using an efcient BAC-based homologous recombination system. Cell Stem Cell 6,80–89 (2010).

[13] Merkle, F. T. et al. Efcient CRISPR-Cas9-mediated generation of knockin human pluripotent stem cells lacking undesired mutations at the targeted locus. Cell Rep. 11, 875–883 (2015).

[14] Lane, D. P. p53, Guardian of the genome. Nature 358, 15–16 (1992).

[15]https://ki.se/en/news/genome-editing-tool-could-increase-cancer-risk

[16]https://www.cnbc.com/2018/06/11/crispr-stocks-tank-after-research-shows-edited-cells-might-cause-cancer.html

[17]https://www.statnews.com/2018/06/11/crispr-hurdle-edited-cells-might-cause-cancer/

[18]Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L. & Corn, J. E. Nat.Biotechnol. 34, 339–344 (2016).

[19]http://home.bt.com/news/science-news/precision-gene-editing-tool-could-increase-cancer-risk-in-patients-11364277357571

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作者 | 代絲雨

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