黑沙蒿藥用價值開發-抗菌、抗炎、抗糖尿病

【摘要】目的本文探討我區防風固沙植物黑沙蒿（鄂爾多斯蒿）在抗菌、抗炎、抗糖尿病方面的藥用價值。方法超聲提取法製備黑沙蒿根、莖、葉的不同溶劑提取物或萃取物，對倍稀釋法測定各提取物及萃取物對實驗菌株（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA）的最低抑菌濃度(MinimumInhibitory Concentration, MIC)，採用小鼠耳腫脹模型測定根95%乙醇提取物及萃取物對小鼠耳腫脹的抑制活性，以過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ）激動劑羅格列酮為陽性對照，採用分子對接手段對黑沙蒿中黃酮類化合物與PPAR-γ進行對接。結果黑沙蒿根、莖、葉的不同極性提取物及萃取物對實驗菌株有不同程度的抑制作用，以莖的乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強（MIC=1.25 mg/mL），根95%乙醇提取物的正丁醇萃取物對大腸桿菌抑制活性最強（MIC=15.00 mg/mL），乙酸乙酯和正丁醇萃取物對MRSA抑制活性相同（MIC=7.50 mg/mL）。根95%乙醇提取物（100.00mg/kg）對小鼠耳腫脹抑制活性優於陽性對照地塞米松（191.91mg/kg），二者無顯著性差異（P>0.05），乙酸乙酯萃取物（100.00mg/kg）對小鼠耳腫脹抑制活性最強。黃酮類化合物與PPAR-γ呈現了較好的對接親和力，但低於羅格列酮（-8.7kcal/mol），以5,3′,4′-三羥基-7-甲氧基黃酮為最好（-8.3kcal/mol），黃酮類化合物A環與B環上的氧原子易與PPAR-γLBD形成1個（Tyr327）或2個（Tyr327、Arg288）關鍵氫鍵。結論黑沙蒿根具有明顯的抗菌、抗炎作用，其中黃酮類化合物可能通PPAR-γ介導的生理路徑產生抗糖尿病活性，具有重要的藥用開發價值。

【關鍵詞】黑沙蒿；抗菌；抗炎；分子對接；黃酮

黑沙蒿（ArtemisiaordosicaKrasch.）為菊科蒿屬植物，又名鄂爾多斯蒿、油蒿、籽蒿、哈拉-啥巴嘎（蒙語），主要分布於我國北部、西北部，防風固沙性能良好，為西北地區代表性植被，近年大面積飛機播種使其資源分布更加廣泛[1-2]。

黑沙蒿味辛苦，性微溫，全草均可入葯。《中華本草》記載其可祛風除濕、解毒消腫，主治風濕性關節炎、感冒頭痛、咽喉腫痛、癰腫瘡癤；蒙醫作消炎、止血、祛風、清熱葯[3]。《中國沙漠地區藥用植物》記載，其可治鼻出血：鮮根，去外皮，折斷用鼻嗅之（如嗅之過久，能引起鼻腔腫脹）；休克暈倒用鮮根聞之即能蘇醒。《內蒙古中草藥》記載其具有止血及治鼻衄、吐血、功能性子宮出血的功效。黑沙蒿中化學成分主要包括黃酮類和萜類（主要為萜烯），以及甾醇類、香豆素類、有機酸類、多糖類、氨基酸類及微量元素等[4-6]。

隨著抗生素的濫用，細菌耐藥性和抗藥性逐漸增加。抗生素的臨床應用受到限制，同時也為治療感染的中成藥新葯研發提供了更大的發展機會。本實驗研究黑沙蒿提取物對常見致病菌的抑制作用，通過小鼠耳腫脹模型初步考察黑沙蒿根的抗炎作用。PPAR-γ核受體主要表達於脂肪組織及免疫系統，與脂肪細胞分化、機體免疫及胰島素抵抗關係密切，成為研究熱點[7]。PPAR-γ配基包括生理性配基和藥理性配基，Lehmann等報道非甾體類抗炎葯吲哚美辛能與PPAR-γ結合併使之活化[8]，Rime等利用分子對接手段從天然產物資料庫中篩選得到7個黃酮和異黃酮類PPAR-γ激動劑[9]。前期研究發現黑沙蒿含有18種黃酮類化學成分[10]，本文從中篩選PPAR-γ激動活性成分，旨在從分子水平闡釋黑沙蒿PPAR-γ激動作用的潛在藥效物質基礎。通過以上研究為進一步開發利用黑沙蒿提供科學依據。

1實驗材料

1.1藥材

黑沙蒿，於2014年10月采自鄂爾多斯市康巴什區，經鑒定為鄂爾多斯蒿。

1.2活性研究

供試菌種金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、大腸桿菌（ATCC 25922）、MRSA由鄂爾多斯市中心醫院檢驗科惠贈；營養肉湯（杭州微生物試劑有限公司生產，批號130509）；血瓊脂平板（天津金章科技發展有限公司，批號130530）。

體重20±2g昆明種小鼠（內蒙古大學實驗動物中心）；醋酸地塞米松片（天津力生製藥股份有限公司，20150104）；二甲苯（天津市風船化學試劑科技有限公司，20140620）。

PPAR-γ蛋白X-ray晶體三維結構文件（來源於RCSB蛋白資料庫，http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, PDB code: 2PRG）[10]，計算機輔助藥物設計專用電腦（Think Station P300工作站）。

2實驗方法

2. 1不同極性提取物的製備

分別稱取1份（6g）乾燥粉碎的黑沙蒿根、莖、葉，分別加入甲醇、95%乙醇和乙酸乙酯各100mL，超聲提取4次，每次0.5 h。合併提取液，母液濃縮乾燥，分別得到甲醇提取物、95%乙醇提取物和乙酸乙酯提取物；另外稱取1份黑沙蒿根（6g），加95%乙醇100mL，超聲提取4次，每次0.5 h，合併提取液，回收乙醇，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及水溶物。

2. 2抗菌活性研究

肉湯培養基經高壓滅菌（121℃，15 Pa）15 min後，冷卻至60℃時倒入培養皿中，製備平板培養基，備用。將供試菌株分別接種於血平板上，置35℃恆溫培養箱培養24 h活化，待用。挑取血平板上形態相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度，再用營養肉湯稀釋至含菌量約107CFU/mL。稀釋後的菌液在15 min內接種，備用。

黑沙蒿提取物用生理鹽水溶解，加入適量吐溫-80增強溶解度。取0.1mL溶解後的樣品用1mL營養肉湯溶解、過濾、除菌。隨後對倍稀釋至第6管，並分別命名，第7管作為陰性對照，第8管作為空白對照。隨後用營養肉湯製備0.5McF的菌懸液，以1:200稀釋。向1-7號管內分別加入0.05mL的菌懸液，混合均勻，所有試管放入35℃恆溫培養箱中培養20 h，取出，觀察生長情況。在對照管符合要求的情況下，以肉眼未見生長的最低藥物濃度（mg/mL）為細菌的MIC。

2. 3抗炎活性研究

昆明種小鼠70隻，雌雄各半，隨機分為7組，每組10隻。空白對照組（CMC6.6mL/kg）、陽性對照組（醋酸地塞米松191.91mg/kg）、總提取物組（95%乙醇提取物100.00mg/kg）、石油醚萃取物組（100.00mg/kg）、乙酸乙酯萃取物組（100.00mg/kg）、正丁醇萃取物組（100.00mg/kg）、水萃取物組（100.00mg/kg）連續灌胃給葯5天，末次給葯0.5h後，將二甲苯（0.1mL/只）均勻塗抹在小鼠右耳的背腹兩面，1h後脫頸處死小鼠，在雙耳同一位置用直徑6mm打孔器打出圓形耳片，精密稱重，計算小鼠耳片腫脹度及抑制率。

耳片腫脹度計算公式：腫脹度=致炎側耳片重量（右耳）－對照側耳片重量（左耳）

腫脹抑制率計算公式：抑制率=（對照組腫脹度－給葯組腫脹度）/對照組腫脹度×100%

2. 4黑沙蒿中黃酮類化合物與PPAR-γ靶點的分子對接研究

PPAR-γ與配體小分子共結晶（PDBcode:2PRG）從RCSB蛋白資料庫下載。晶體結構預處理採用分子建模軟體包Chimera 1.5.3（National Institutes of Health, Bethesda,MD, USA）[11]。A鏈或B鏈從2PRG中分離，去除C鏈及所有配體和水分子（關鍵水分子除外），計算蛋白質質子化態，備用。受體加氫及gridbox設置採用分子建模軟體包MGLTools 1.5.4（The Scripps Research Institute, La Jolla,CA, USA）處理[12-13]。

化合物平面結構用ChemDraw軟體繪製，通過Chem3D Ultra 8.0（CambridgeSoftCorporation, Cambridge, MA, USA）轉換成三維結構並能量最小化，載入電荷，備用。分子對接採用軟體AutoDock Vina 1.1.2的默認設置和計分函數（The ScrippsResearch Institute, La Jolla, CA, USA）[14]。PyMOL v1.5用於分析和觀察配體-蛋白質的對接構象（SchrodingerLLC, New York, NY, USA）。

3實驗結果

3. 1抗菌活性研究

Table 1.黑沙蒿根、莖、葉的提取物的提取率及對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑制濃度（MIC, mg/mL）

由表1可知，黑沙蒿根、莖、葉的不同極性提取物對實驗菌株均有不同程度的抑制作用，其中以莖的乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強（MIC=1.25 mg/mL），葉的95%乙醇提取液對大腸桿菌的抑制活性最好（MIC=19.47 mg/mL）。

Table 2.黑沙蒿根95%乙醇提取物的萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和MASA的最低抑制濃度（MIC, mg/mL）

由表2可知，黑沙蒿根95%乙醇提取物的萃取物中以乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌抑制活性最好（MIC=3.75 mg/mL），正丁醇萃取物對大腸桿菌抑制活性最好（MIC=15.00 mg/mL），二者對MRSA抑制活性相同（MIC=7.50 mg/mL）。

3.2抗炎活性研究

Table 3.二甲苯致小鼠耳腫脹實驗結果(x±S，n=10)

註：與模型組比較，*P

由表3可知，黑沙蒿根95%乙醇總提取物的乙酸乙酯萃取物組小鼠的耳腫脹度比模型組小（PP

3. 3黑沙蒿中黃酮類化合物基於PPAR-γ靶點的分子對接研究結果

PPAR-γ配體結合域（ligand binding domain, LBD）可容許不同配體進入並形成適當構象從而組成配體-受體複合物[15]。晶體結構2PRG包含了不對稱分子單元A和B。分子再對接發現只有A鏈給出了所有關鍵的配體-受體氫鍵組合，同時，A鏈被認為與激活態的PPAR-γ蛋白結構相近[16]。因此，A鏈被用於PPAR-γ激動劑的分子對接實驗。

將黑沙蒿中已知的18種黃酮類化學成分與PPAR-γ進行分子對接，每個化合物給出9個分子對接結果，並按照親和力進行排名。與陽性對照葯羅格列酮相比，所有化合物與PPAR-γ的對接親和力均低於羅格列酮，從中篩選得到5個親和力較高的化合物（絕對值大於8.0，羅格列酮為-8.7 kcal/mol），其中以化合物3為最高（-8.3 kcal/mol）。篩選結果見表4。

Table 4黑沙蒿中PPAR-γ激動劑虛擬篩選結果

陽性對照葯羅格列酮與PPAR-γ LBD的Tyr473、His323、Gln286、Ser289形成4個氫鍵結合(黃色虛線部分)，得分最高的化合物3（5,3′,4′-三羥基-7-甲氧基黃酮）與Tyr327、Arg288形成2個氫鍵結合(黃色虛線部分)。

Fig. 1羅格列酮和化合物3與PPAR-γ LBD的對接構象. (A)羅格列酮與PPAR-γ關鍵氨基酸殘基Tyr473, His343, Gln286和Ser289形成氫鍵結合(-8.7 kcal/mol); (B)化合物3與PPAR-γ關鍵氨基酸殘基Tyr327和Arg288形成氫鍵結合(-8.3 kcal/mol).

篩選出的其它化合物均與PPAR-γLBD活性位點形成1個（Tyr327）或2個（Tyr327、Arg288）氫鍵結合。所有化合物與陽性對照葯羅格列酮的結合模式均不同，提示對接親和力及激動活性與羅格列酮有所不同。羅格列酮、化合物3與PPAR-γ受體的對接構象如圖1所示。

4討論

黑沙蒿提取物具有明顯的抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及MRSA的活性。其中以乙酸乙酯提取物活性最強。為後續的黑沙蒿藥效物質基礎研究提供了活性導向。

炎症是機體組織對內外損傷因子所產生的一種局部的防禦性反應，目前常見的抗炎藥物篩選模型是小鼠耳腫脹法，炎症細胞浸潤導致耳部急性滲出性的炎症水腫[17]。實驗中黑沙蒿根提取物在小鼠抗炎實驗模型中藥效顯著，接近或優於醋酸地塞米松組的藥效，證明黑沙蒿根具有良好的抗炎效果。

分子對接中配體最佳對接模式的選擇不僅需要考慮對接分數，同時應結合對接模型的構象觀察[18-20]。陽性對照化合物與目標受體蛋白co-crystal的選擇、受體蛋白的處理、對接流程及條件的優化以及陽性對照化合物的再對接試驗至關重要。本文採用分子對接技術篩選得到的黑沙蒿PPAR-γ配體成分可能成為PPAR-γ激動劑的先導化合物。

5結論

黑沙蒿根具有明顯的抗菌、抗炎作用，其中的黃酮類化合物可能通過與PPAR-γ靶點的結合產生抗糖尿病活性，本研究為黑沙蒿的藥物用資源開發利用提供了研究基礎及理論依據。

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作者簡介

肖斌，藥學博士，鄂爾多斯市中心醫院主管藥師，臨床藥學實驗室負責人。多年來主要從事藥物化學、藥理學、分子對接等方面的研究。迄今發表論文10餘篇，SCI論文9篇，以項目負責人承擔各級科研立項8項。

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