科學家在植物中實現超長基因片段高效精準無贅敲入/替換編輯

新聞 06-13

5月17日，國際學術期刊《自然-通訊》（Nature Communications）在線發表了中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康研究組題為CRISPR/Cas9-mediated gene targeting in Arabidopsis using sequential transformation 的研究論文。該研究報道了一種在擬南芥中基於二代轉化策略與CRISPR/Cas9系統的超長基因片段高效精準敲入/替換技術。它可以在擬南芥基因組精準定向地實現單氨基酸或大片段的插入或替換，且編輯位點無需任何標記輔助篩選，效率高達5%-10%。此研究大大推進了CRISPR系統在植物中的應用，為植物基因定點編輯提供了一種新方法。

生物基因組的精準編輯是一項具有挑戰性的工作，主要包括基因的敲除、敲入、替換等。近年來，CRISPR/Cas9系統在多種生物中實現了高效的基因敲除編輯。它先在基因組產生位點特異性地雙鏈斷裂（DSB），這些雙鏈斷裂再依賴細胞的兩種內源機制來修復，一種是易錯易突變的非同源末端連接（NHEJ），另一種是需要同源DNA模板介導的無錯無差異的同源重組修復（HDR）。由於同源重組這種修復機制的發生概率較低，因此目前基因編輯領域比較高效的是造成基因突變的敲除編輯。

前期研究表明（Miki et al., 2017），雙鏈斷裂可以提高植物細胞內同源重組的效率。另外，在高等植物中，通過序列特異性核酸酶（SSN）和供體DNA的配合，初步可以實現靶標基因的敲除或敲入。但是這些技術仍有弊端，其陽性篩選都必須依賴於靶標基因附近的抗生素或除草劑抗性基因來提高效率，而這些抗性對於目的植株來說是多餘的、累贅的，所以這並不是最理想的基因編輯。少數不依賴篩選標記的基因編輯效率極低，因此限制了這些技術的實用性。

朱健康研究組設計並使用由卵細胞和早期胚胎細胞特異性啟動子DD45驅動的Cas9系統，「一代轉化」野生型擬南芥，獲得在雌性配子和早期胚胎特異表達Cas9蛋白的植株，檢測並挑選出Cas9活性最高的株系作為母株。再依賴細胞內源同源重組機制，將基因特異的sgRNA元件和無需帶有篩選輔助標籤的目的序列DNA，「二代轉化」擬南芥Cas9母株，以常規PCR和Southern印跡檢測子代基因型。sgRNA元件引導Cas9定位並切割基因，目的DNA作為同源重組的修復模板，從而實現了擬南芥基因原位、精準、無縫、無累贅的改變。研究人員對2個編碼擬南芥重要去甲基化酶的內源基因ROS1和DME分別進行了四個外源大片段敲入測試：在ROS1蛋白C端分別敲入720bp的綠色熒光蛋白GFP和長達1653bp的熒光素酶蛋白LUC，在DME蛋白N端和C端分別敲入GFP；同時也進行了兩個單氨基酸替換測試：將DME蛋白第1633位的脯氨酸替換成丙氨酸，將DME蛋白第1648位的苯丙氨酸替換成丙氨酸。六個測試均分別獲得了穩定可遺傳的單株系，效率為5.3% ~ 9.1%。

該研究以二代轉化策略結合CRISPR/Cas9系統，使得在高等植物基因組中敲入或替換短至數個、長至上千鹼基的DNA序列片段成為可能，精準無贅，且可由常規PCR直接鑒定。該技術具有簡單、高效以及部分適用性的優點，大大推動了高等植物基因編輯領域的發展，為育種生產和植物科學研究提供了新思路和新技術。

該項工作得到了中科院的經費支持。