PNAS：中美研究人員揭示艾滋病病毒顆粒組裝過程，推進治療藥物開發

導 讀

近日，北京大學工學院生物醫學工程系陳匡時研究團隊和美國喬治亞理工學院研究人員合作，在納米尺度下揭示了病毒核糖核酸組織及調控病毒顆粒的完整組裝過程。相關研究成果以「Roles of Gag-RNA interactions in HIV-1 virus assembly deciphered bysingle-molecule localization microscopy」為題，於2018年6月11日發表在國際學術期刊PNAS（《美國國家科學院學報》）雜誌上。這一發現有望推進艾滋病治療藥物和方法的開發。

研究背景

基於單分子定位技術的超分辨顯微成像（簡稱單分子定位顯微術，single molecule localization microscopy, SMLM）通過「計算」實現，橫向解析度目前已達10 nm左右。具體工作原理是：基於全內反射照明光路，用激活光和激發光控制成像區每次僅有少量、隨機、離散的單個熒光分子發光，再通過高斯擬合分析單個熒光分子點擴展函數中心實現高精度的空間定位，最後將圖片進行疊加形成一幅超分辨圖像。如利用熒光探針標記細胞內不同的目標物進行多色超分辨成像，不僅可以獲得單個目標物的超分辨信息，還可以精確分析不同目標物的空間結構與相互關係，極大地加強人們對細胞內複雜的生命現象與過程的探索能力。

單粒子跟蹤光敏定位顯微鏡（single-particle tracking PALM，spt-PALM）。單粒子跟蹤技術結合了錄像顯微鏡和數字相機，以一定的的頻率連續拍攝標記的單分子，經過圖像數據處理，描繪出單分子的運動軌跡。如目標分子為綠色熒光蛋白、量子點（200-500nm）或者膠體金（40-100nm）標記，直徑往往小於可見波長範圍（390-780nm），因此會散射波長，形成同心圓的衍射圖文，中心處解析度可精確到10nm。

單分子定位顯微術（SMLM）圖片來自網路

結果速覽

在 HIV-1組裝過程中，病毒結構蛋白Gag在細胞膜上形成一個不成熟的衣殼，含有數以千計的Gag分子。Gag核衣殼(NC)和病毒RNA(vRNA)之間的相互作用被認為是驅動了病毒的組裝，但這些相互作用的確切作用仍然不清楚。由於先前的研究表明，Gag二聚體或缺少NC域的三聚體突變體(GagZiL)可以不依賴於RNA結合而形成不成熟的衣殼，通常假定vRNA通過Gag形成低序多聚體來驅動Gag組裝，但對於後續組裝是非必需的。

本研究利用光敏定位顯微鏡（photoactivated localization microscopy，PALM)和單粒子跟蹤光敏定位顯微鏡（single-particle trackingPALM，spt-PALM），通過細胞質膜Gag和Gag NC突變體的分布和移動來研究vRNA在HIV-1組裝中的作用。結果表明，正如預期，Gag和GagZiL均以類似的基本裝配單位進行組裝。出乎意料的是，這兩種蛋白在隨後的組裝通路上有不同的變化，Gag簇密度漸近增加而GagZiL簇密度則呈線性增加；此外，Gag保持在恆定的速度有定向運動而GagZiL沒有，表明這兩種蛋白質經歷了不同的外部驅動力。當NC刪除時Gag呈現單體形式且無法完成組裝。上述結果表明，vRNA不僅能誘導Gag形成低有序的基本裝配單元，也對後續組裝過程中的支撐和結構保持非常重要。

Fig. 1. The effect of mutation in the NC domain on VLP formation and vRNA packaging

Fig. 2. PALM imaging and cluster formation analysis of Gag and NC mutants

Fig. 3. Dynamics of Gag and NC mutants at the PM, assessed by spt-PALM.

Fig. 4. Schematic model of how viral RNA promotes Gag assembly at thePM, based on PALM and spt-PALM analysis.

總而言之，研究人員利用具有超高解析度的「光敏定位顯微鏡」觀察發現，在靜電作用下，最常見的艾滋病病毒類型HIV-1的主要結構蛋白Gag會以二聚體或三聚體為單位進行組裝，並在細胞膜上形成緊密的組裝結構。研究表明，病毒核糖核酸（vRNA）與Gag的交互作用是艾滋病病毒顆粒在宿主細胞膜順利形成的必要條件，這種蛋白對新的HIV-1病毒顆粒的組裝非常重要。在這一過程中，Gag與vRNA通過靜電作用結合，以vRNA為支架，在宿主細胞膜上大量聚合，最終形成數千個病毒顆粒。

結 語

本研究利用SMLM研究HIV-1病毒的組裝機制，HIV-1病毒RNA(vRNA)介導成千上萬的Gag蛋白在細胞膜表面組裝成一個病毒粒子。一般認為，vRNA只觸發了Gag的組裝，而對後續的組裝是非必要的；然而，本研究發現：vRNA是整個組裝必不可或缺的，是組裝中間體的支架並通過平衡裝配環境中的外力作用維持其結構。這些以前未發現的功能將有助於人們對HIV-1和其它逆轉錄的理解。

艾滋病病毒顆粒直徑僅150納米，最新研究在納米尺度下揭示了病毒核糖核酸組織及調控病毒顆粒的完整組裝過程。這一發現有望推進艾滋病治療藥物和方法的開發。

ABSTRACT

During HIV-1 assembly, the retroviral structural protein Gag forms an immature capsid, containing thousands of Gag molecules, at the plasma membrane (PM). Interactions between Gag nucleocapsid (NC) and viral RNA (vRNA) are thought to drive assembly, but the exact roles of these interactions have remained poorly understood. Since previous studies have shown that Gag dimer- or trimer-forming mutants (GagZiL) lacking an NC domain can form immature capsids independent of RNA binding, it is often hypothesized that vRNA drives Gag assembly by inducing Gag to formlow-ordered multimers, but is dispensable for subsequent assembly. In this study, we examined the role of vRNA in HIV-1 assembly by characterizing the distribution and mobility of Gag and Gag NC mutants at the PM using photo activated localization microscopy (PALM) and single-particle tracking PALM (spt-PALM). We showed that both Gag and GagZiL assembly involve a similar basic assembly unit, as expected. Unexpectedly, the two proteins underwent different subsequent assembly pathways, with Gag cluster density increasing asymptotically, while GagZiL cluster density increased linearly. Additionally, the directed movement of Gag, but not GagZiL, was maintained at a constant speed, suggesting that the two proteins experience different external drivingforces. Assembly was abolished when Gag was rendered monomeric by NC deletion. Collectively, these results suggest that, beyond inducing Gag to formlow-ordered multimer basic assembly units, vRNA is essential in scaffolding and maintaining the stability of the subsequent assembly process. This finding should advance the current understanding of HIV-1 and, potentially, other retroviruses.

參考文獻：

1.Yantao Yang, Na Qu,Jie Tan, Muaz N. Rushdi, Christopher J. Krueger, and Antony K. Chen.Roles of Gag-RNA interactions in HIV-1 virus assembly deciphered bysingle-molecule localization microscopy.PNASJune 11, 2018. 201805728; published ahead of print June 11, 2018.

2. 新華社：中美研究人員揭示艾滋病病毒顆粒組裝過程，推進治療藥物開

http://www.ddcpc.cn/kj/201806/t20180613_132613.shtml

本期編輯：Annabella

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