Angew.Chem.Int.Ed：適配體介導的原位空間互補技術進行活細胞內天然RNA轉錄的實時成像
引言
基於生物分子動力學過程以實現胞內的直接成像，對於理解細胞內自身的功能以及作用機制具有重要意義。然而，與已經相對成熟的基於熒光蛋白的蛋白質成像相比，RNA成像技術仍然沒有得到很好地開發。而研究RNA 的分布和動態過程的可視化對RNA定位和輸送過程有著重要的作用，因此，RNA 可視化的相關研究一直引起科研人員的廣泛關注。早在20世紀80年代，首次開發了RNA熒光原位雜交（FISH）技術用以在固定細胞中對RNA進行成像，而為了實現在活細胞內對RNA成像，研究人員開發了各種方式對RNA轉錄進行設計。Singer團隊則首次使用MS2熒光報告體系對基因編碼的RNA進行成像，但在此過程中對目標RNA的設計可能會改變RNA的丰度以及轉錄行為，並且未能結合的MS2熒光報告基因通常會在溶質中產生較高的熒光背景。因此，對天然RNA的成像研究仍舊是個挑戰。
成果簡介
近日，物理生物學研究室和上海光源生物成像中心主任樊春海教授在Angewandte Chemie International Edition上發表了題為「In Situ Spatial Complementation of Aptamer-Mediated Recognition Enables Live-Cell Imaging of Native RNA Transcripts in Real Time」的論文。文章中闡述了一種類似雙分子熒光互補技術的方法，通過將可結合3,5-二氟-4-羥基亞苄基咪唑啉酮（一種可滲透細胞的熒光團、DFHBI）的RNA適配體劈裂成兩部分，當在細胞中進行遺傳編碼時，新生的mRNA轉錄本就會招募兩個劈裂的適配體片段並將兩個片段距離拉近，從而產生一個激活的DFHBI結合位點併產生熒光。這種遺傳編碼的適配體介導的熒光互補技術（AiFC）不需要事先對mRNA進行修飾，並且可以靶向任何感興趣的位置，因此，這一研究將為RNA原位成像開闢新的途徑。
圖文解讀
方案一： (a)設計原理和(b)細胞內表達的基於花椰菜的AiFC探針，用於未經修飾的RNA的活細胞成像。
圖1. AiFC探針的熒光和凝膠分析。a）左圖：在是否含有1mM目標RNA的情況下，10mM DFHBI和1mM的劈裂適配體反應後的熒光強度。右圖：在是否含有目標RNA的情況下，AiFC探針的8％PAGE分析。在等摩爾目標RNA的存在下，形成了1mM AiFC探針的熒光結構（綠框）。b）DFHBI-1T的化學結構，AiFC探針與目標RNA雜交的二級結構。c）點突變的AiFC探針在體外重新締合的效率的熱圖（右）。DFHBI或G4結構域的突變會降低熒光的激活。右側和底部的強度圖分別對應於垂直和水平虛線的熒光強度。
圖2.體外轉錄的AiFC探針可以檢測活細胞內的天然mRNA。a)共定位的Cy3-DNA探針(紅色)和AiFC探針(綠色)在HeLa細胞中靶向mRNA的共聚焦成像。核用Hoechst染色劑染色（藍色）。b)內源性mRNA與相應AiFC探針在HeLa細胞和HuMSC細胞中的可視化。
圖3.基因編碼的AiFC探針在活細胞內用於mRNA成像。a)通過轉染AiFC質粒的mRNA成像原理。通過轉染編碼AiFC探針的質粒，得到β-actin mRNA在HeLa細胞中分布的共聚焦圖成像圖。核用Hoechst染色劑，顯示為藍色。c)以β-actin mRNA為靶點轉染AIFC質粒的對照細胞(綠色)和細胞核(藍色)染色，下方顯示亮場圖像，標度為50 μm。將編碼了劈裂-花椰菜AiFC探針（青色）的質粒轉染進10000個HeLa細胞的流式細胞術直方圖以及對照組細胞(綠色) 流式細胞術直方圖；d)用AiFC質粒靶向β-actin mRNA後轉染進細胞，顯示actin部分為綠色，細胞核為藍色，下方為明場圖像。
總結展望
作者通過設計一種創新性的AiFC策略實現了對RNA成像，該策略不僅不需要對天然RNA 進行修飾，並且大大地降低了背景信號。此外，這種方法具有通用性，適用於各種哺乳動物細胞內的RNA，且兩種探針是在質粒上通過基因編碼的方式進行細胞表達，避免了外源RNA的運輸。由於AiFC是一種使DFHBI和RNA適配體結合從而產生熒光的通用方法，通過進一步對適配體進行優化，AiFC大有可能為哺乳動物細胞未修飾的mRNA轉錄本的定量觀察和實時成像提供一套強大的工具，並廣泛用於生物及生物醫學領域。
文獻鏈接
https://doi.org/10.1002/ange.201707795
DOI:10.1002/ange.201707795
團隊介紹
樊春海：博士生導師，現任物理生物學研究室和上海光源生物成像中心主任。於1996年獲南京大學學士學位，2000年獲南京大學博士學位，2001-2003年，在加州大學聖巴巴拉分校讀博士後。於2004年入選中國科學院百人計劃，2007年獲得國家傑出青年基金，2011年任科技部重大科學研究計劃（納米）首席科學家。已發表論文300餘篇，論文引用20000餘次,入選全球高引用科學家（High Cited Researchers, Thomson Reuters），並應邀在Chemical Reviews, Account of Chemical Research，Chemical Society Reviews等雜誌撰寫研究綜述。擔任美國化學會ACSApplied Materials & Interfaces副主編，ScientificReports，Advanced Healthcare Materials，Journal of Materials Chemistry，Electroanalysis, Particle等雜誌編委，Advanced Materials客座編輯，併入選國際電化學學會會士(ISE fellow)和英國皇家化學會會士(FRSC)。
主要研究方向：生物感測與成像；生物光子學；DNA納米技術與DNA計算。
課題組主頁：http://physbio.sinap.ac.cn/faculty/Chunhai_Fan.htm
編輯：瀟卡卡
校正：御用鑒賞師
推送：開心瀟瀟樂
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