中科院武漢病毒所肖庚富組成功篩選得到四級病原拉沙病毒的入侵抑製劑

近日，中國科學院武漢病毒研究所/病毒學國家重點實驗室肖庚富研究組在四級病原拉沙病毒（Lassa virus， LASV）的藥物治療領域取得重要進展，成功篩選到阻斷拉沙病毒入侵的藥物：拉西地平和苯氧司林；並對其作用機制進行了詳細闡述。該成果發表在病毒學權威雜誌Journal of Virology上，原文題為「Screening and Identification of Lassa Virus Entry Inhibitors from an FDA-Approved Drugs Library」（基於FDA批准藥物庫篩選並鑒定拉沙病毒入侵抑製劑）

LASV屬沙粒病毒科（Arenaviridae），哺乳類沙粒病毒屬（Mammarenavirus），引發烈性傳染病拉沙熱，被美國疾控中心歸類為 A類生物恐怖病原（Category A bioterrorism agent）。LASV的天然宿主是嚙齒類多乳鼠，人主要通過接觸含有病毒的動物排泄物或氣溶膠感染，人與人之間也會發生相互傳播。LASV主要在西非地區流行，每年約 30 萬-50 萬人感染，在住院患者中的致死率最高可達 70%，倖存者往往也會伴有耳聾等嚴重後遺症。在今年年初，奈及利亞爆發了該國史上最嚴重的一次拉沙熱疫情，截至 3 月15 日，已有 365 人確認感染拉沙熱，其中 81 人死亡。了解LASV的致病機制，發展針對LASV的治療手段非常必要。目前還沒有 FDA 批准的針對 LASV 的特效藥物和疫苗，治療手段僅限於在感染早期使用廣譜抗病毒藥物利巴韋林，因此迫切需要研發高效、特異的抗LASV藥物。

病毒入侵是病毒生命周期至關重要的一步，是抗病毒藥物設計的重要靶點之一。我們構建了以水泡性口炎病毒為骨架、囊膜蛋白為 LASV 囊膜糖蛋白 GPC（glycoprotein complex）的假型病毒和重組病毒，假型病毒和重組病毒由於囊膜蛋白與 LASV 相同，因此可以在生物安全二級的條件下模擬 LASV 的入侵過程。由於其攜帶報告基因，可用於高通量篩選實驗。

我們通過對 1018 種 FDA 批准的藥物文庫進行高通量篩選，鑒定出兩種特異性抑制 LASV 入侵的藥物：拉西地平和苯氧司林，它們的 IC50 分別為 2.6 μM 和 5.3 μM （圖1）。通過進一步的機制探索，我們發現兩個藥物都是通過抑制酸性 pH 誘導的膜融合從而阻止 LASV 的入侵。通過篩選適應性突變，明確拉西地平的作用靶點是信號肽 SSP 胞外域的第 40 位蘇氨酸（T）；突變為賴氨酸（T40K）後對拉西地平的敏感性降低。進一步的研究發現 T40 突變為 K、精氨酸（R）、 天冬氨酸（D） 的重組病毒都具有顯著的耐藥性，而 T40 突變為丙氨酸（A） 的重組病毒沒有表現出耐藥性。對這些突變病毒的生長特性考察發現， T40K 突變的病毒生長特徵最接近野生型病毒，而 T40R 和 T40D 突變的病毒生長明顯弱於野生型病毒。

圖1：基於FDA藥物庫篩選得到LASV入侵抑製劑：拉西地平和苯氧司林。

在此基礎上，我們考察拉西地平和苯氧司林的廣譜抗病毒活性，發現拉西地平對於 Mopeia virus（MOPV） 和A級病原 Guanarito virus（GTOV） 也有顯著的抑制效果， IC50 分別為 4.8 μM和 6.2 μM； 苯氧司林對於 MOPV、 GTOV 和 Chapare virus（CHPV） 有著顯著的抑制作用， IC50 分別為 8.3 μM， 6.1 μM 和 8.0 μM（圖2）。

圖2：拉西地平和苯氧司林對抗哺乳類沙粒病毒和絲狀病毒廣譜抗病毒效果。

我們的實驗揭示了兩種 FDA 批准的小分子藥物能夠在微摩爾濃度下有效地抑制 LASV 的入侵過程，其作用機制是通過與 SSP 和 GP2 亞基相互作用，穩定 GPC 膜融合前的構象，抑制膜融合而發揮其抗病毒效果。本研究鑒定出有潛力的 LASV 入侵抑製劑， 為進一步揭示沙粒病毒入侵機制和發展抗沙粒病毒藥物奠定了實驗基礎。

這種老葯新用的策略可以加快候選藥物的臨床實驗進程，適用於新發、 烈性傳染性疾病的應急處置。以往針對 EBOV 的藥物研究鑒定出了用於治療高血壓和矽肺的中藥粉防己鹼可以有效抑制 EBOV 的入侵過程，針對寨卡病毒（ZIKV）和日本乙型腦炎病毒（JEV）的 FDA 批准藥物篩選工作也鑒定出了有效抑制病毒的藥物，證明了這種的策略的可行性。

碩士研究生王培林為本文第一作者，副研究員王薇為通訊作者。

ABSTRACT

Lassa virus (LASV) belongs to the Mammarenavirus genus (family Arenaviridae) and causes severe hemorrhagic fever in humans. At present, there are no Food and Drug Administration (FDA)-approved drugs or vaccines specific for LASV. Herein, high-throughput screening of an FDA-approved drug library was performed against LASV entry by using pseudotype virus bearing LASV envelope glycoprotein (GPC). Two hit compounds, lacidipine and phenothrin, were identified as LASV entry inhibitors in the micromolar range. A mechanistic study revealed that both compounds inhibited LASV entry by blocking low-pH-induced membrane fusion. Accordingly, lacidipine showed virucidal effects on the pseudotype virus of LASV. Adaptive mutant analyses demonstrated that replacement of T40, located in the ectodomain of the stable-signal peptide (SSP), with lysine (K) conferred LASV resistance to lacidipine. Furthermore, lacidipine showed antiviral activity against LASV, the closely related Mopeia virus (MOPV), and the new world arenavirus Guanarito virus (GTOV). Drug-resistant variants indicated that the V36M in ectodomain of SSP mutant and V436A in the transmembrane domain of GP2 mutant conferred GTOV resistance to lacidipine, suggesting the interface between SSP and GP2 is the target of lacidipine. This study shows that lacidipine is a candidate for LASV therapy, reinforcing the notion that the SSP-GP2 interface provides an entry-targeted platform for arenavirus inhibitors design.

IMPORTANCE

Currently, there is no approved therapy to treat Lassa fever; therefore, repurposing of approved drugs will accelerate the development of a therapeutic stratagem. In this study, we screened an FDA-approved library of drugs and identified two compounds, lacidipine and phenothrin, which inhibited Lassa virus entry by blocking low-pH-induced membrane fusion. Additionally, both compounds extended their inhibition against the entry of Guanarito virus, and the viral targets were identified as the SSP-GP2 interface.

PI簡介：肖庚富，博士，研究員。病毒學國家重點實驗室副主任，中國科學院「百人計劃」入選者。先後於1989、1992、1999年獲同濟醫科大學醫學學士、醫學碩士、武漢大學理學博士學位。曾任武漢大學生命科學學院教授、博士生導師、院長助理。2006年入選教育部「新世紀優秀人才」支持計劃，2008年入選中國科學院「百人計劃」。現任中國科學院武漢病毒研究所研究員、副所長，病毒生物化學學科組組長。在重要醫學病毒膜蛋白介導病毒進入細胞的分子機制及抑製藥物（Entry inhibitor）、新概念疫苗設計、蛋白質構象病研究領域具有紮實的工作積累。主持國家重大科學研究計劃、973、國家自然科學基金等多項課題。2004年以來發表SCI論文50餘篇，代表性論文：Lancet（柳葉刀）.2004. 363(9413): 938-47; J Biol Chem. 2007. 282(1):381-9; Autophagy.2011.7(2):205- 16；J Virol.2011. 85(13):6252-62; Antiviral Res. 2014.104:7-14; J Virol. 2015. 89(10):5668-86。

學科組官方網站：http://159.226.126.127:8082/web/17215/home

來源：中科院武漢病毒所

本期編輯：Tony

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