加了「標籤」的三代轉錄組到底有什麼不一樣？

圖1 UMI三代轉錄組——確認過標籤，是真的轉錄本

給全長轉錄組加上一個標籤（UMI），就可以多得到20%以上的有效數據，實現轉錄本絕對定量（圖1）。

這個「標籤」真有這麼神奇嗎？知道您肯定有很多疑問，今天，科技君就來帶您深挖 「標籤」背後的秘密。（下文中UMI等同於「標籤」 ↓↓↓）

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「三代轉錄」VS「UMI三代轉錄組」

三代轉錄組基於三代測序超長讀長優勢，在測序過程中，無需打斷，直接對polyA+DNA進行反轉錄得到cDNA，然後通過cDNA擴增，啞鈴型文庫構建，sequel測序，信息分析，最終得到全長轉錄本序列。在信息分析階段基於轉錄本序列信息和reads數進行相關的分析。

UMI三代轉錄組的實驗步驟與目前的三代測序完全一致的，區別僅在於反轉錄階段對每一個轉錄本分子都添加了分子標籤（UMI），信息分析階段通過識別轉錄本序列和UMI來進行轉錄本定性和定量分析（如圖2）。

圖2 UMI三代轉錄組流程圖

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UMI三代轉錄組可檢測到更多新轉錄本

圖3 UMI三代轉錄組可發現更多低丰度新轉錄本，

並減少擴增/測序錯誤引入的假陽性

從圖3可以看出， UMI三代轉錄組可檢測到更多的新轉錄本，主要是因為有UMI和無UMI的情況下，新轉錄本判斷標準不同。

判定某一條轉錄本為新轉錄本需要滿足兩個條件：（1）與參考基因集比對結果顯示為新轉錄本；（2）有一定的拷貝數支持（在無UMI的情況下，有3個以上拷貝支持才將該轉錄本判定為可靠的新轉錄本；在有UMI的情況下，有2個以上UMI支持即將該轉錄本判定為可靠的新轉錄本）。

基於以上標準，在目前測序飽和度較低的情況下，UMI三代轉錄組可得到更多的新轉錄本。隨著測序數據量的增加，這一差別可能會逐漸減小。

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UMI三代轉錄組新轉錄本結果更可靠

如圖3所示，在無UMI的情況下，基於拷貝數進行新轉錄本判斷，有可能會將一些擴增/測序錯誤的序列誤判為新轉錄本。而UMI三代轉錄組基於UMI種類進行判斷，要求新轉錄本有兩個以上UMI支持，即要求原始樣本中有兩條以上序列支持，大大降低了擴增/測序錯誤引入假陽性的可能，得到的新轉錄本結果更可靠。

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UMI三代轉錄組可實現轉錄本絕對定量

圖4 UMI三代轉錄組可實現絕對定量

雖然測序中沒有信號放大過程，但三代轉錄組建庫過程中是存在擴增步驟的。由於PCR偏向性，建庫過程中轉錄本可能會存在擴增不平衡的情況（即有的序列擴增效果好，有的序列擴增效果差），導致最終定量結果與真實情況不符，這也是目前限制三代轉錄組定量研究的一大因素。

UMI三代轉錄組在反轉錄階段對每一條轉錄本序列都加上UMI，最終基於UMI種類進行定量。在測序達到飽和的情況下，可以根據UMI種類直接「數出「原始樣本中的轉錄本數目，實現轉錄本的絕對定量。在測序數據量不飽和的情況下，UMI也可以用於校正PCR擴增不平衡，得到更準確的相對定量結果。

撰稿：張 義

編輯：市場部

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