湯富酬/喬傑合作組發布人類著床前胚胎髮育的單細胞多組學研究成果
本文轉自BioArt
BioArt按：2018年上半年國內研究人員圍繞「人類早期胚胎髮育染色質調控的動態圖譜」完成的相關研究可謂高潮迭起，先是3月份中科院基因組所劉江、山東大學陳子江與廣州醫科大學三附院劉見橋合作團隊利用DNase-seq技術，在Cell雜誌上首次報道了人類早期胚胎髮育過程中染色質開放性是如何逐步建立的（Cell丨中國學者首次報道人類早期胚胎髮育染色質調控的動態圖譜）；5月份清華大學頡偉、那潔與鄭州大學第一附屬醫院孫瑩璞合作團隊利用miniATAC-seq技術，在Nature雜誌上揭示了人類早期胚胎髮育過程中染色質變化與基因轉錄的密切關係（Nature | 孫瑩璞/頡偉/那潔合作團隊發表人類早期胚胎染色質調控研究）。上述兩篇論文各有側重，儘管有一部分結論不一致，但是共同繪製了人類早期胚胎髮育過程中染色質局部開放區域的全景圖。日前，來自北京大學湯富酬/喬傑合作團隊高精度的單細胞多組學測序技術 single-cell COOL-seq，首次在單細胞解析度，解析了人類著床前胚胎髮育過程中DNA甲基化組和染色質狀態組的重編程過程，以及染色質狀態與DNA甲基化之間的相互關係等關鍵生物學特徵，相關工作發表在Nature Cell Biology雜誌上。上述三篇文章，某種意義上講其研究核心相同，但是由於技術手段不同，得出得結論並非都是一致的。那麼為什麼會不一致？各有什麼優缺點？如何分析判斷？希望讀者能夠用審慎的眼光去閱讀。正如NCB雜誌同時配發的評論文章中所述，圍繞人類早期胚胎髮育的表觀組範圍的研究仍然有較大的空間。
圖片設計源於「八卦」，在此代表人類來自精子的父源基因組與來自卵細胞的母源基因組在受精後的「陰陽融合」。整幅畫面傳遞著人類受精卵在發育過程中，父源基因組（金色蛇）染色質快速打開並且其開放程度迅速超過母源基因組（紅色蛇），並將這一逆轉的開放程度不對稱狀態一直維持到4-細胞胚胎階段這一含義。
2018年6月18日，北京大學北京未來基因診斷高精尖創新中心、生命科學學院生物動態光學成像中心湯富酬課題組攜手北京大學第三醫院喬傑課題組合作在Nature Cell Biology在線發表了題為Single-cell Multi-omics Sequencing of Human Early Embryos的研究論文。利用湯富酬課題組此前發展的高精度的單細胞多組學測序技術single-cell COOL-seq【1】，首次在單細胞解析度，解析了人類著床前胚胎髮育過程中DNA甲基化組和染色質狀態組的重編程過程，以及染色質狀態與DNA甲基化之間的相互關係等關鍵生物學特徵。
湯富酬教授課題組和喬傑教授課題組長期緊密合作，致力於人類著床前胚胎髮育過程中基因表達的表觀遺傳學調控機理方面的研究。採用湯富酬課題組發展的單細胞RNA-seq轉錄組測序技術，於2013年繪製了完整的人類著床前胚胎的高精度單細胞轉錄組圖譜【2】；之後利用湯富酬課題組發展的微量細胞DNA甲基化組高通量測序技術，於2014年在國際上首次實現了對人類早期胚胎髮育過程中DNA甲基化組重編程的系統研究【3】。2018年該團隊利用單細胞DNA甲基化高通量測序技術，首次在單細胞解析度深入解析了人類著床前胚胎髮育的DNA甲基化組圖譜【4】，揭示了人類著床前胚胎的去甲基化重編程，實際上是高度有序的大規模去甲基化和局部的DNA加甲基化動態平衡的結果，並揭示了父母源基因組差異甲基化等特徵。
為了進一步在極限解析度研究染色質狀態在DNA甲基化重編程過程中的動態重構過程，該研究利用湯富酬課題組發展的國際領先的單細胞多組學測序技術（single-cell COOL-seq，single-cell chromatin overall omic-scale landscape sequencing ，對一個單細胞可以同時進行染色質狀態、DNA甲基化、基因組拷貝數變異、以及染色體倍性的全基因組測序技術），在單細胞、單鹼基解析度系統地描繪了人類著床前胚胎髮育過程中，各個發育階段表觀基因組多個層面的動態變化。對於存在高比例非整倍體的樣品（例如人類著床前胚胎、人類癌症樣品等），利用少量細胞的表觀基因組測序方法，例如ChIP-seq、ATAC-seq、DNase-seq等，得到的結果有可能會被混雜在樣品中的異常的非整體細胞所混淆。因此該研究利用湯富酬課題組發展的scCOOL-seq技術，可以在單細胞水平有效地區分整倍體和非整倍體細胞，在排除非整倍體細胞後、利用整倍體胚胎的單細胞數據，更為精準地反映人類著床前胚胎髮育過程中表觀基因組多層面的動態變化。該研究的主要發現有：
01
受精後的19個小時以內，高度特化的精子和卵子都經歷了大規模的染色質重構過程，來自精子的父源基因組染色質被迅速打開，而來自卵細胞的母源基因組染色質的開放程度降低（精子的平均染色質開放程度為5%，卵子為42%，受精卵為34%）。隨後父母源基因組染色質的開放程度同時回落，直至合子基因激活的8-細胞胚胎階段之後染色質開放程度再次增加，到桑椹胚階段染色質開放程度達到最高點（2-細胞的平均染色質開放程度為32%, 4-細胞為30%, 8-細胞為27%，桑椹胚時期為40%；圖1a）。利用該研究鑒定出的61,403個近端染色質開放區域進行非監督層次聚類分析發現，和小鼠胚胎相似，在人類早期胚胎髮育過程中，近端染色質開放區域具有強烈的發育階段特異性，更重要的是近端染色質開放區域在合子基因激活時期，即4-細胞到8-細胞時期，發生了最劇烈的染色質重構過程，著床前胚胎聚類分為兩支，一支是4-細胞階段之前的胚胎，另外一支是8-細胞階段之後的胚胎（圖1b）。
圖1. 人類著床前胚胎（整倍體胚胎）發育過程中染色質開放程度的動態變化（a）以及近端（基因啟動子區域）染色質開放區域的非監督層次聚類分析（b）
02
首次發現不同於小鼠受精卵，人類受精卵在發育過程中父源基因組染色質快速打開並且其開放程度迅速超過母源基因組，並將這一逆轉的父母源基因組染色質開放程度不對稱狀態一直維持到4-細胞胚胎階段。該研究首次實現了在人類著床前胚胎的單個細胞內，將父母源基因組信息精確分開並進行DNA甲基化和染色質開放程度的分析（圖2a）。在此基礎上，該研究發現，人類受精卵在受精後19個小時左右，其父源基因組的染色質已經比母源基因組更為開放，並且這一不對稱狀態一直維持到4-細胞胚胎階段才結束（圖2b）。這與小鼠中完全不同，小鼠胚胎在受精後很快每個胚胎細胞中其父源基因組染色質的開放程度變得跟母源基因組的一樣，並且此後一直維持這種父母源基因組染色質開放程度的對稱狀態。人類受精卵中父源基因組更快速打開並且開放程度迅速超過母源基因組，這可能更有利於DNA去甲基化酶在父源基因組上的結合，從而加速父源基因組的去甲基化進程以及其他表觀遺傳學重編程進程。
圖2. 人類著床前胚胎髮育過程中父母源基因組DNA甲基化與染色質開放程度的不對稱分布（a, b）
03
首次發現不同於小鼠胚胎，人類著床前胚胎具有更為開放、鬆散的染色質結構。該研究首次實現了對人類與小鼠著床前胚胎父母源基因組染色質開放程度的系統定量比較（圖2c）。基於同一技術平台的絕對定量比較，該研究發現與小鼠胚胎相比，在對應的胚胎階段，人類著床前胚胎具有更開放鬆散的染色質結構，而這一鬆散的染色質結構有可能更容易出現基因組不穩定性，進而導致人類著床前胚胎髮育到囊胚階段的比率遠低於小鼠（人類胚胎的囊胚發育率只有40-60%，而小鼠胚胎的囊胚發育率高達95%以上）。小鼠胚胎的父源基因組和母源基因組在受精後被迅速打開，之後染色質開放程度回落，到2-細胞時期達到最低點；與此不同，人類胚胎母源基因組在受精後其染色質開放程度即開始下降，至8-細胞階段降至最低點。而人類胚胎父源基因組在受精後先被迅速打開，之後染色質開放程度逐漸回落，到8-細胞階段降至最低點。人類和小鼠染色質狀態重構模式的差異剛好與這兩個物種合子基因激活時間的差異吻合。
04
首次發現受精後，人類雌性胚胎中父源X染色體迅速去甲基化並被激活，到2-細胞階段後，父源X染色體的DNA甲基化水平已經遠低於母源X染色體，並在此後一直維持這一逆轉的不對稱性。該研究可以精確地區分雌性和雄性胚胎，並在此基礎上系統研究了人類雌性著床前胚胎中父母源X染色體的DNA甲基化和染色質開放程度的差異（圖2d）。每個雌性細胞中有兩條X染色體，其中一條來自精子（父源X染色體），另外一條來自卵細胞（母源X染色體）。scCOOL-seq技術可以基於雜合單核苷酸多態性（SNP）信息在每個單細胞中精確地區分父母源X染色體。該研究表明，與全基因組的DNA甲基化重編程和染色質狀態重構特徵一致，受精後，父源X染色體迅速去甲基化並被激活，到2-細胞階段之後，父源X染色體的DNA甲基化水平已經顯著低於母源X染色體的甲基化水平，並在此後一直維持這一不對稱狀態。與此同時，父源X染色體的染色質狀態也迅速變得比母源X染色體更為開放，並一直維持到了4-細胞階段。
圖2. 人鼠物種間父母源基因組染色體開放程度的比較（c）以及單個雌性胚胎細胞中父母源DNA甲基化與染色質開放程度的差異（d）
05
首次在單細胞解析度，揭示了人類著床前胚胎髮育過程中，各種基因組元件DNA去甲基化和染色質狀態重構過程的非同步性（圖3a,b）。該研究發現，人類著床前胚胎髮育過程中，基因啟動子區域DNA甲基化異質性強烈的基因和染色質狀態異質性強烈的基因是兩類不同的基因。例如從4-細胞到桑椹胚階段，啟動子區域染色質狀態有強烈異質性的基因其啟動子DNA甲基化沒有顯著的異質性（圖3c中I類基因），這些基因主要參與染色體組裝、染色質的修飾和細胞周期。這暗示了染色質重構相關基因在這些胚胎時期的一部分細胞中活躍表達，而這種表達異質性主要是由這些基因啟動子區域染色質狀態的異質性驅動的。從受精卵到囊胚階段，啟動子區域DNA甲基化有強烈異質性的基因其啟動子染色質狀態沒有顯著的異質性（圖3c中II類基因），這些基因主要參與免疫炎症反應和化學刺激的感知。這暗示了免疫炎症反應和化學刺激相關基因的DNA去甲基化在這些時期的胚胎的一部分細胞中還沒有完成。
圖3. 各個元件DNA甲基化異質性（a）和染色質狀態異質性（b），以及基因啟動子區DNA甲基化異質性和染色質狀態異質性的聯繫（c）
06
通過轉錄抑制實驗，首次發現，在人類著床前胚胎髮育過程中，持續轉錄對於大量基因維持其啟動子區域染色質持續處於開放狀態具有重要作用。該研究發現，在人類和小鼠著床前胚胎髮育過程中，合子基因激活伴隨著啟動子區域大片段（長度大於300bp）染色質開放區域比例的大幅度增加（圖4）。使用RNA聚合酶抑製劑α-Amanitin處理受精卵、廣譜抑制其轉錄活動，這些胚胎髮育到8-細胞階段時1700多個（35%）基因會失去啟動子區域的染色質開放狀態。這些依賴於持續轉錄的啟動子大片段染色質開放區域對應的基因，很多都在胚胎髮育過程中發揮重要作用，這說明持續轉錄對於維持大量胚胎髮育重要基因啟動子區域持續處於開放狀態起了關鍵作用。
圖4. 持續轉錄對於染色質開放狀態的維持是必須的
07
對人類著床前胚胎進行了大規模的基因組調控區域預測，共得到37000多個候選增強子區域。利用scCOOL-seq數據，該研究結合染色質開放程度和DNA甲基化信息，進行了人類和小鼠的候選增強子預測。該研究發現對於人類和小鼠著床前胚胎中的染色質處於開放狀態的候選增強子，只有700多個是在這兩個物種中同時處於染色質開放狀態，說明在著床前胚胎髮育過程中處於活躍狀態的增強子具有很強的物種特異性。與此同時，該研究對人類著床前胚胎中鑒定出的接近40萬個染色質開放區域（NDR）進行了轉錄因子結合富集分析，發現相對於滋養外胚層細胞，多能性的內細胞團細胞中的遠端（距離基因轉錄起始位點2kb以外）染色質開放區域更富集轉錄因子ZNF281的結合序列；而相對於內細胞團細胞，滋養外胚層細胞中的遠端染色質開放區域更富集轉錄因子CDX2、TFAP2C（AP2γ）的結合序列，這為今後研究人類著床前胚胎髮育過程中轉錄因子調控下游基因的表達提供了基礎。
該研究利用國際領先的單細胞多組學高通量測序技術，深度解析了人類著床前胚胎髮育過程中，單個整倍體細胞中DNA甲基化組重編程伴隨的染色質狀態的重構過程，並系統地研究了人類胚胎父母源基因組在單個細胞中DNA甲基化與染色質開放程度的不對稱分布（下圖）。首次定量比較了人類和小鼠胚胎中父母源基因組的染色質開放程度，發現了人類胚胎不同於小鼠胚胎的物種特異性的關鍵表觀遺傳學特徵，例如：與小鼠胚胎相比，人類著床前胚胎的染色質狀態更為鬆散；不同於小鼠胚胎，人類著床前胚胎中父源基因組染色質狀態在卵裂階段早期比母源基因組更為開放。這為今後人們繼續研究人、鼠兩個物種早期胚胎中表觀遺傳學的異同提供了理論基礎，明確了利用小鼠作為模式生物研究哺乳動物早期胚胎髮育的優勢和局限性。同時為研究非整倍體等發育異常的胚胎、以及相關的反覆流產等臨床醫學問題提供了新思路和新研究手段。
北京大學北京未來基因診斷高精尖創新中心博士生李琳、博士生高雲，四川大學研究員郭帆，以及北京大學第三醫院博士生任一昕為該論文的並列第一作者；湯富酬教授和喬傑教授為該論文的共同通訊作者。
圖為湯富酬教授在2018年全國細胞生物學大會上做特邀報告。周學迅攝影。
值得注意的是，NCB同期配發了來自法國居里研究所 Deborah Bourc』his等題為「A single-cell chromatin map of human embryos」的評述文章（下圖），高度評價了上述工作。該評論中指出，該工作與此前劉江組和頡偉組的工作一道展示了人類早期胚胎髮育過車程中染色質的動態變化圖譜，然而此前劉江組發現在人胚胎合子期基因組激活階段（8細胞期）打開的染色質中，富集了著名的OCT4基因的結合位點【5】，而湯富酬組的研究中並沒有發現在8細胞期OCT4在染色質開放區域的近端或遠端有富集，從這個角度來講，與頡偉組使用ATAC-seq技術得到的合子基因組激活時期OCT4的富集狀況相似【6】。
鑒於目前有三篇獨立的研究工作聚焦人類早期胚胎髮育的表觀組學的研究，Deborah Bourc』his等在評論中還就當前這個領域是否仍然有研究的空間表達了自己的看法，評論中寫到「Considering the amount of data produced by Li et al. and others, one could wonder whether there is still room for descriptive, epigenome-wide studies in human preimplantation embryos? The answer is yes, as many aspects have not been characterized yet」。圍繞人類早期胚胎髮育的多層次組學研究目前儘管有多個組取得很不錯的研究成果，然而更加精確與細緻化的認識仍然需要更多的研究來呈現。
參考文獻
1. Guo, F., Li, L., Li, J., Wu, X., Hu, B., Zhu, P., Wen, L., and Tang, F. (2017). Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells.Cell research.
2. Yan, L., Yang, M., Guo, H., Yang, L., Wu, J., Li, R., Liu, P., Lian, Y., Zheng, X., Yan, J., et al. (2013). Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells.Nat Struct Mol Biol20, 1131-1139.
3. Guo, H., Zhu, P., Yan, L., Li, R., Hu, B., Lian, Y., Yan, J., Ren, X., Lin, S., Li, J., et al. (2014). The DNA methylation landscape of human early embryos.Nature511, 606-610.
4. Zhu, P., Guo, H., Ren, Y., Hou, Y., Dong, J., Li, R., Lian, Y., Fan, X., Hu, B., Gao, Y., et al. (2018). Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos.Nature genetics.
5.Gao, L. et al. Chromatin accessibility landscape in human early embryos and its association with evolution.Cell173, 248–259 (2018).
6.Wu, J. et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA.Nature557, 256–260 (2018).
-END-
TAG:Science |