功能宏基因組是什麼鬼？幹什麼用？
功能宏基因組是什麼鬼？幹什麼用？
吳崇明中國醫學科學院&北京協和醫學院藥用植物研究所
環境和人體中存在的微生物蘊含著海量的功能基因，可能產生大量結構新穎、功能獨特的活性分子。但是這些微生物，特別是海洋和人體微生物，絕大部分尚不能單獨培養，因此難以用傳統的培養和測序方法對每種細菌的功能、活性和代謝產物進行詳細地解析和研究。為了解決這個問題，功能宏基因組(Functionalmetagenomics)方法應用而生。
所謂功能宏基因組，就是將樣品中的全體微生物的DNA提取、剪切和插入到合適的載體上(如Fosmid質粒)；然後轉化到易於培養的模式細菌(例如E.Coli等)中，構建包含樣品中全部微生物DNA信息的宏基因組文庫；下一步，對文庫菌進行培養和擴大，並利用藥理、生化、和分析化學技術對文庫菌進行活性篩選，獲得陽性克隆菌；通過提取陽性克隆菌的載體並測序，得知賦予陽性克隆菌功能的插入DNA序列；最後通過對插入DNA序列進行解析，與其表現出的功能進行關聯，從而獲得細菌DNA序列的相應功能，並進行驗證。
1.功能宏基因組學研究歷史
2008年，威斯康星大學大學JoHandelsman教授首次用功能宏基因組學方法鑒定了土壤細菌中能夠抵抗β-內醯胺抗生素的基因——β-內醯胺酶，相關結果發表在ISMEJ上（Allen HK, et al.Functional metagenomics reveals diverse beta-lactamases in a remote Alaskansoil.ISME J. 2009;3(2):243-51.）。同時，Handelsman教授對舞毒蛾幼蟲腸道的細菌抗-抗生素譜也進行了分析，這也是將功能宏基因組應用到腸道菌群的第一個實例（AllenHK, et al. Resident microbiota of the gypsy moth midgut harbors antibioticresistance determinants. DNA Cell Biol. 2009;28(3):109-17.）。隨後，多個課題組利用該方法對不同來源的細菌樣本進行了抗生素耐受研究，發現了不同種類的對抗不同抗生素的細菌基因。後續的研究中，人們將抗-抗生素基因研究也轉向了應對其他脅迫的研究，比如高鹽（CulliganEP, et al. Functional metagenomics reveals novel salt tolerance loci from thehuman gut microbiome.ISME J. 2012 Oct;6(10):1916-25.）（Note:脅迫有多種，相同的脅迫可以由不同的方法或化合物實現，剖析不同條件下細菌基因的耐脅迫基因，對於應對不同的人體健康危機具有重要參考價值）
除了研究抗生素耐受性基因之外，功能宏基因組學方法也廣泛應用於細菌代謝基因的研究。在Handelsman教授發表第一篇功能宏基因組學研究論文一年後，比利時列日大學的MorenoGalleni於2009年9月在ISMEJ發表論文，報道了利用功能宏基因組學在北極土壤樣品中發現能夠水解羧甲基纖維素的細菌基因（BerlemontR. et al., Insights into bacterial cellulose biosynthesis by functionalmetagenomics on Antarctic soil samples. ISME J. 2009;3(9):1070-81.）。2010年，法國Universitéde Toulouse的GabriellePotocki-Veronese將功能宏基因組應用於人體腸道微生物組，並發現了73個能夠降解碳水化合物的細菌酶，從而首次對人體腸道微生物組的碳水化合物水解酶信息進行了全景掃描（TasseL, et al. Functional metagenomics to mine the human gut microbiome for dietaryfiber catabolic enzymes.Genome Res. 2010;20(11):1605-12.）。
2010年，法國INRA的HervéM. Blottière做了一個有趣而大膽的嘗試。他們直接用宏基因組文庫菌與含有NF-kB報告基因的人細胞進行孵育，觀察不同細菌對NF-kB報告基因的影響，從而利用細胞實驗篩選宏基因組的功能基因（LakhdariO, et al.Functional metagenomics: a high throughput screening method todecipher microbiota-driven NF-κB modulation in the human gut. PLoS One.2010;5(9). pii: e13092.）。這是一個工作量非常巨大的方法，而且直接用細菌孵育細胞存在諸多問題。然而，卻給人們提了一個醒——原來功能宏基因組可以這麼玩兒！（Note:相比直接用菌與細胞共孵育，我更推薦用細菌裂解物或者細菌培養外液孵育細胞，以減少菌本身對細胞的危害）
2.功能宏基因組學的改進
功能宏基因組學提出的前3年（2009-2012）受到了熱烈的追捧，也取得了諸多令人振奮的成果。但是很快就陷入了平庸，原因是這個方法非常依賴於宏基因組文庫的構建和基因的異源表達，而文庫構建和保持過程中不可避免出現基因的丟失，宿主菌也不可能正確表達所有細菌來源的基因片段，所以該方法的產出率並不高。同時，在活性篩選方面大多採用抗生素、環境脅迫和底物代謝的方法進行廣泛篩選，這些方法只能反映細菌的很少一部分功能，而大部分與疾病相關的功能則不能體現，因此該方法必須經過大幅改良後，才能繼續發揮強大的功效。大量科學家為此付出了艱辛的勞動。
2.1多宿主表達
2010年，美國洛克菲勒大學的合成生物學頂級科學家SeanF. Brady教授，首次應用功能宏基因組學方法發現新型細菌代謝產物。由於功能宏基因組必須依賴基因的異源表達，而異源表達可能導致許多基因並不能表達或者不能正確表達，導致所得的有用信息受到很大限制。為此，Brady課題組將宏基因組學在6種不同的細菌中進行表達，然後通過顯色或抗生素篩選方法對陽性克隆進行篩選，並分離獨特的代謝產物（CraigJW, et al. Expanding small-molecule functional metagenomics through parallelscreening of broad-host-range cosmid environmental DNA libraries in diverseproteobacteria. Appl Environ Microbiol. 2010;76(5):1633-41.）。這是Brady教授第一次使用功能宏基因組學方法，他後續對此方法進行了改進（IqbalHA, et al. Natural Product Discovery through Improved Functional Metagenomicsin Streptomyces. J Am Chem Soc. 2016 Aug 3;138(30):9341-4.）。
2.2穩定同位素標記技術（DNA stable-isotopeprobing (DNA-SIP)）
2000年，美國Universityof Warwick的J.Colin Murrell利用穩定同位素標記技術+16SDNA測序方法鑒定了環境微生物中能夠代謝甲醇的細菌（RadajewskiS, et al. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 2000Feb 10;403(6770):646-9.）。2014年，加拿大Universityof Waterloo的Charles進一步使用5種底物（glucose,cellobiose, xylose, arabinose, and cellulose）的同位素標記方法分析了土壤中能夠代謝這些糖的細菌分類情況（VerasteguiY, et al. Multisubstrate isotope labeling and metagenomic analysis of activesoil bacterial communities. MBio. 2014;5(4):e01157-14.）。（Note：這種方法雖然能夠快速鑒定能夠代謝某些特定底物的細菌，但是要求所用底物必須能夠成為DNA的構成原料，而且必須是被細菌大量消耗的底物，對於用量微小的藥物或者不容易進入DNA合成的底物，則難以使用這個方法鑒定其代謝菌。）
2.3微流控晶元技術
針對傳統功能篩選方法不能廣泛體現細菌宏基因組的生物活性，而直接的活性篩選需要巨大的細胞培養工作，美國Universityof Cambridge的FlorianHollfelder嘗試使用微流控晶元技術解決上述問題（ColinPY, et al. Ultrahigh-throughput discovery of promiscuous enzymes by picodropletfunctional metagenomics. Nat Commun. 2015 Dec 7;6:10008.）。
（1）宏基因組文庫在E.coli中表達，並將單個細菌包封在一個2 pl的脂滴中；（2）細菌與裂解劑和熒光底物共包封；（3）在合適的培養條件下孵育細菌2天，通過基因活性產生可檢測的反應產物；（4）將乳劑在此注射到分選晶元中，對每個脂滴進行分析，利用亮度或熒光強度對脂滴進行分選；（5）將陽性細菌脫乳化，並回收DNA；（6）將DNA轉化E coli進行擴增；（7）在經過第二輪篩選後，對DNA進行測序分析。（Note：這種方法很高效，但是需要專門的設備，技術壁壘很高，需要與有條件的人合作。）
2.4細胞功能合併化合物分離鑒定
在Blottière的工作基礎上，Brady教授利用文庫菌的培養液對含有NF-kB報告基因的人細胞進行孵育，在75000個克隆中尋找到了26個潛在可影響NF-kB表達的基因。進一步，他們從陽性菌中獲得了能夠發揮藥理功能的化合物——N-acyl-3-hydroxypalmitoyl glycine (commendamide)，其是GPCR的激動劑。（CohenLJ, et al. Functional metagenomic discovery of bacterial effectors in the humanmicrobiome and isolation of commendamide, a GPCR G2A/132 agonist. Proc NatlAcad Sci U S A. 2015 Sep 1;112(35):E4825-34.）
2.5功能宏基因組+生物信息學方法
功能宏基因組可用的活性檢測方法有限，特別是對於那些目的性明確的研究。為此，將功能基因組學方法和生物信息學方法相結合，可以部分解決這個問題。2015年，德國LarsI. Leichert課題組首次將兩種方法結合起來，發現了具有脂酶活性的細菌基因（MasuchT, et al. A combined bioinformatics and functional metagenomics approach todiscovering lipolytic biocatalysts. Front Microbiol. 2015 Oct 13;6:1110.）。雖然他們的發現並沒有特別重大的醫學意義，但是開啟了一個研究的新模式。2017年，Brady課題組進一步利用該方法，從人腸道菌群中發現了GPCR調節劑，從而證明了該方法在醫學應用中的重大價值（CohenLJ, et al. Commensal bacteria make GPCR ligands that mimic human signallingmolecules. Nature. 2017 Sep 7;549(7670):48-53.）。
3.功能宏基因組的一般步驟
(1)建立表達文庫；
(2)對文庫菌的表達產物進行分析，發現與對照菌相比有明顯新產物的克隆；
(3)分離該單克隆，並對表達載體進行測序，發現與新產物相關的功能基因；
(4)同時分離鑒定該未知新產物的結構；
(5)如果該化合物為新化合物或者生物合成過程未知，則進一步通過生物信息學和分子生物學方法，確定該化合物的生物合成過程；
(6)與(3)和(4)同時進行菌提取物藥理活性研究，若發現該菌提取物有較好活性，則可以快速確定其中的活性化合物。
這樣，綜合(1)-(6)的結果，將有助於快速發現活性天然產物，確定其生物合成通路，同時實現活性天然產物的大規模綠色生產。從而建立一個海洋藥物發現和研究的綜合體系。
圖2.功能宏基因組操作流程（步驟見前文敘述；圖片摘自UfartéL, et al. Discovery of new protein families and functions: new challenges infunctional metagenomics for biotechnologies and microbial ecology. FrontMicrobiol. 2015 Jun 5;6:563.）
圖3.基於微流控晶元的功能宏基因組研究（步驟見前文敘述；圖片摘自UfartéL, et al. 2015. Front Microbiol）
4.功能宏基因組應用於新化合物發現和合成生物學研究
傳統的通過克隆和異源表達潛在功能基因來獲得新型天然產物的方法，受到表達宿主菌不能識別獨特的啟動子以及對表達產物（轉錄本和蛋白質）進行正確的剪接和修飾，導致遭遇失敗的概率極大，使得整個前期研究工作的努力付之東流。為了深入挖掘海洋微生物資源，我們需要改變研究思路，從「推測生物合成途徑——克隆潛在功能基因——在宿主中異源表達——驗證活性產物」的傳統研究規程變成「建立基因文庫——發現產生新產物的克隆——鑒定新型產物和相應功能基因——解析生物合成途徑」的功能宏基因組研究策略。
這個策略與傳統思路相比的優勢在於，我們先行鑒定了有新產物生成，然後解析生物合成通路，也就是先有了最終的結果，從而確保整個研究課題必定是成功的，只不過我們不能預先確定該新產物是否是新型結構分子而已。如果運氣好，所得產物是新結構分子的話，那麼就可以確保一項重大發現，如果運氣不好，所得產物非新結構物質，但通過仔細分析和對比功能基因的來源與結構，仍可望獲得有意義的發現，特別是當該產物是目前難以大規模製備的物質時，我們就可能為該化合物的規模化製備建立一個新體系，從而具有了較大的經濟價值。
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