溶血卵磷脂在內皮細胞泡沫化模型中的作用探討
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導讀
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病已經成為當今社會影響人類健康的重要疾病，目前病因尚未完全明確，一般認為動脈粥樣硬化是多病因疾病，是多因素共同作用的結果。
溶血卵磷脂在內皮細胞泡沫化模型中的作用探討
黃永菊 劉正霞 周萍 劉瑩 魯翔
210011 江蘇省南京市，南京醫科大學第二附屬醫院老年科(黃永菊，劉正霞，周萍，劉瑩)；210029 江蘇省南京市，南京醫科大學(魯翔)
【摘要】目的 探討製作內皮細胞脂質化損傷的泡沫化細胞模型的有效方法並觀察初次與再次脂質化損傷後細胞活力的改變。方法 觀察溶血卵磷脂(lysophos phatidyl choline，lpc)的絕對濃度和lpc 相對濃度對細胞存活率的影響，lpc相對濃度包括人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的接種密度和lpc 干預體積。採用油紅O檢測內皮細胞泡沫化結果。結果 lpc干預後，HUVECs 的接種密度與細胞存活率呈正相關，lpc濃度和lpc干預體積與細胞存活率呈負相關。再次脂質化組的內皮細胞比初次脂質化組的細胞存活率更高，且差異有統計學意義。結論 綜合運用lpc 的絕對濃度與相對濃度不同調控參數更有助於製作出一個適宜的內皮細胞泡沫化模型。
【關鍵詞】溶血卵磷脂；人臍靜脈內皮細胞；動脈粥樣硬化
基金項目：國家自然科學基金(81470501)
冠狀動脈粥樣硬化性心臟病已經成為當今社會影響人類健康的重要疾病，目前病因尚未完全明確，一般認為動脈粥樣硬化是多病因疾病，是多因素共同作用的結果。近年來多數學者支持「內皮損傷反應學說」，認為本病的各種主要危險因素最終都損傷動脈內膜，其中高血脂損傷內皮細胞導致脂肪沉積出現不同程度的內皮細胞泡沫化，被認為是動脈粥樣硬化的最重要的危險因素[1-2]，血管內皮的損害是動脈粥樣硬化的始動因素[3-4]。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL) 是主要的致動脈粥樣硬化因素[5-6]，ox-LDL 的主要活性成分是溶血卵磷脂(lysophos phatidyl choline，lpc)，lpc 能模擬ox-LDL 致動脈粥樣硬化作用[7-9]。目前很多文獻報道用lpc 干預人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)製作內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型。如何製作理想的內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型，是進一步實驗研究的基礎。目前在很多文獻里一般都僅僅關注了lpc 的終濃度，也就是lpc 的絕對濃度對細胞模型成敗的影響，但是筆者在多次製作內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型實踐中發現，lpc 的相對濃度對內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型的成敗也很重要，lpc 的相對濃度主要通過細胞不同的接種密度和lpc 不同的干預終體積來體現。希望本文總結的實驗經驗能夠給製作內皮脂質化損傷的泡沫化細胞模型的初學者一些借鑒。
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材料和方法
1.1 主要試劑與儀器CKX41 顯微鏡：Olympus 公司；CO2 細胞培養箱：Thermo 公司；生物安全櫃：BAKER公司；ECM培養基：Sciencell 公司；溶血卵磷脂(lpc)：Sigma 公司；DMEM basic：Gibco 公司；紅油O試劑盒：ScienCell 公司。
1.2 實驗細胞HUVECs 購於美國ATCC。
1.3 實驗方法
1.3.1 lpc 配製：稱取lpc 2.5 mg 放於滅菌EP管中，用無血清DMEM 25 ml，配製成濃度為100 mg/L 的lpc母液，以0.22 μm 混合纖維素微孔濾膜正壓過濾除菌，分裝後－20 ℃保存備用。
1.3.2 細胞活力檢測：採用細胞增殖和毒性檢測試劑盒(CCK-8)進行檢測，上述細胞活力檢測實驗按照試劑盒使用說明進行操作，加入CCK-8 後1 h，酶標儀讀取各組OD 值反映所在組的細胞活力。細胞存活率(％)＝(實驗孔OD值－空白孔OD值) /(對照孔OD值－空白孔OD值)×100％。
1.3.3 HUVECs 的不同接種密度對lpc 干預後細胞存活率的影響：實驗分6 組，每組分別設對照組和實驗組，每組3 個復孔，HUVECs 接種於96 孔板，HUVECs的不同接種密度分別為A 組0.5×104/孔、B 組0.75×104/孔、C 組1.0 × 104/孔、D 組1.25 × 104/孔、E 組1.5×104/孔、F 組2×104/孔，每孔加入終體積100 μlECM 完全培養基培養12 h後換液，對照組加入無lpc無血清DMEM，終體積100 μl，實驗組參照文獻[8-9]常用的方法，用終濃度含10 μg/ml lpc 的無血清DMEM，終體積100μl；培養24h檢測細胞活力。
1.3.4 不同濃度的lpc 對HUVECs 細胞存活率的影響：實驗分5 組，每組3 個復孔。A 組：對照組，無lpc；B 組：lpc 5 μg/ml；C 組：lpc 10 μg/ml；D 組：lpc 20 μg/ml；E 組：lpc 40 μg/ml。HUVECs 接種於96 孔板，細胞密度1.0×104/孔，每孔加入終體積100 μl ECM 完全培養基培養12 h 後換液，A 組加入終體積為100 μl無lpc 無血清DMEM；B、C、D、E 組加入lpc 的終濃度分別為5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml 的無血清DMEM 100 μl 繼續培養24 h 測細胞活力。
1.3.5 lpc 的不同干預體積對HUVECs 細胞存活率的影響：實驗分6 組，每組分別設對照組和實驗組，每組3 個復孔，HUVECs 接種於96 孔板，對照組與實驗組的HUVECs 的密度均為1.0×104/孔，每孔加入終體積100 μl ECM 完全培養基培養12 h 後換液，根據實驗設計換液後各組加入培養液的終體積分別為A 組50μl，B 組75 μl，C 組100 μl，D 組125 μl，E 組150 μl，F組200 μl，每個對照組為無lpc 無血清DMEM，每個實驗組為含終濃度10 μg/ml lpc 同體積的無血清DMEM，培養24 h 檢測細胞活力。
1.3.6 初次與再次脂質化損傷的HUVECs 存活率變化實驗：實驗分2 組，每組分別設對照組與實驗組，各組3 個復孔。A 組初次脂質化組：對照組，HUVECs接種於96 孔板，加終體積100 μl ECM 完全培養基培養12 h，換無血清DMEM 終體積100 μl 繼續培養24 h，用於檢測；實驗組，HUVECs 接種於96 孔板，加終體積100 μl ECM 完全培養基培養12 h，換終濃度10 μg/ml lpc 的無血清DMEM 終體積100 μl 繼續培養24 h，用於檢測。B 組再次脂質化組：對照組，取初次脂質化經過lpc 干預24 h 後的HUVECs，再次胰酶消化傳代接種於96 孔板，後續培養及干預條件與A 組對照組相同；實驗組，取初次脂質化經過lpc 干預24 h後的HUVECs，再次胰酶消化後接種於96 孔板，後續培養及干預條件與A 組實驗組相同。
1.4 統計學方法各組數據以均數±標準差( .x±s)表示，數據分析採用GraphPad Prism 5 軟體進行處理，2組間比較採用t 檢驗，多組間比較採用方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。
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結果
2.1 HUVECs 的不同接種密度對lpc 干預後細胞存活率的影響結果顯示隨著內皮細胞接種密度的增加，lpc 干預後細胞存活率隨之增加，細胞接種密度在(0.5～1.5)×104/孔各組間細胞存活率差異均有統計學意義，2×104/孔組的細胞存活率比1.5×104/孔組稍有增高，2 組間差異無統計學意義。各組細胞存活率結果見圖1。
2.2 不同濃度的lpc 對HUVECs 細胞存活率的影響結果顯示，lpc 干預組各組間隨著lpc 濃度的增加，細胞存活率出現下降趨勢，5 μg/ml 組細胞存活率高達(89.96±3.06)％，40 μg/ml 組細胞存活稀少，存活率僅有(5.18±0.88)％ ，各組細胞存活率結果見圖2。
2.3 lpc 的不同干預體積對HUVECs 細胞存活率影響的結果在同樣的細胞接種密度，同樣的lpc 濃度干預條件下，lpc 不同的干預體積也是對細胞存活率顯示出了明顯的影響，從50 μl/孔到150 μl/孔各組細胞存活率隨著lpc 干預體積的增加細胞存活率逐漸降低，並且每組間都有統計學差異，200 μl/孔組的細胞存活率比150 μl/ 孔組的細胞存活率進一步降低，但是差異無統計學意義，各組細胞存活率結果見圖3。
2.4 初次與再次脂質化損傷的HUVECs 存活率實驗結果再次脂質化損傷的內皮細胞存活率比較特殊，不是因為再次受到lpc 損傷而進一步下降，反而較初次脂質化損傷的細胞存活率出現了明顯的升高，而且差異有統計學意義，各組細胞存活率結果見圖4。
2.5 lpc 干預後內皮細胞泡沫化檢測結果結果顯示無lpc 干預的對照組HUVECs 內未見油紅O 染色(見圖5，6)，lpc 干預的實驗組HUVECs 內出現較多的油紅O 染色(見圖7，8)，提示HUVECs 出現了泡沫化。
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討論
本實驗顯示無lpc 干預的對照組HUVECs 內未見油紅O 染色，給予lpc 干預的實驗組HUVECs 內出現較多的油紅O 染色，顯示HUVECs 出現了泡沫化，表明本實驗成功製作了lpc 脂質化損傷內皮的泡沫化細胞模型。有文獻報道用油紅O 染色觀察組織或細胞的脂質化程度[10-11]，油紅O 染色量的多少可以反映HUVECs 內的脂肪滴多少，是直觀體現HUVECs 泡沫化程度的一個指標。
本實驗顯示lpc 5 μg/ml 時細胞存活率與對照組相比降低較少，lpc 的濃度從10～40 μg/ml，各組細胞存活率明顯下降，各組間有統計學差異。本實驗顯示lpc 的濃度達20 μg/ml 及40 μg/ml 時細胞存活率僅為(13.31±4.46)％和(5.18±0.88)％，鏡下觀察存活細胞不僅數量稀少而且生長狀態不好，難以用於有效實驗研究，本實驗結果與文獻報道一致[12]。用lpc 作用於HUVECs 製作脂質化損傷內皮的泡沫化細胞模型時，一般都認為lpc 的終濃度為10 μg/ml 時是製作內皮脂質化損傷泡沫化細胞模型的適宜濃度，但是實踐中發現在終濃度10 μg/ml 的lpc 干預條件下，不同的細胞接種密度和不同的lpc 干預體積導致的細胞存活率差別很大，可能出現lpc 干預組細胞存活率過低或者無lpc 干預的對照組細胞增長過度密集，出現生長抑制的現象。
目前文獻報道在進行lpc 干預HUVECs 的脂質化損傷實驗時，96 孔板上HUVECs 接種密度為(0.1～2)×104/孔不等[13-14]，各文獻報道細胞接種密度差異巨大，但是細胞接種密度對細胞存活率的影響未見報道。本實驗顯示HUVECs 不同接種密度對細胞存活率的影響也很大，在0.5×104/孔時細胞增殖速度緩慢，lpc干預後細胞存活數量稀少。接種數量為(0.75～1.5)×104/孔時細胞增長速度有明顯增加，而且lpc 干預後細胞存活率從(35.41±4.00)％逐漸增加到(76.80±5.83)％，而且各組間有統計學差異。但是2×104/孔組lpc 干預後細胞存活率增高速度放緩，與1.5×104/孔組細胞存活率差異無統計學意義，而且此時對照組細胞出現增長過度密集，可能引發細胞生長抑制。這說明內皮細胞脂質化損傷的細胞模型成敗不僅與合適的lpc 干預濃度有關，也與適宜的HUVECs 接種密度有關。細胞接種密度過於低時，細胞增長緩慢而且lpc干預後細胞稀少可能無法獲得有效的細胞數量進行有效的實驗研究。增加細胞接種密度可以增加細胞增長速度並且提高lpc 干預後的細胞存活率。但是細胞接種密度增加到一定程度可能給對照組細胞帶來過度增長，出現生長抑制現象從而影響實驗結果的準確性，這一點需要避免出現。
本實驗還發現lpc 干預後細胞存活率與培養孔內的lpc 干預體積有關，也就是與lpc 干預時的培養液的終體積有關，實驗結果顯示在同樣的細胞接種密度和同樣的lpc 終濃度條件下，lpc 干預的實驗組細胞存活率與lpc 干預體積呈負相關。實驗結果表明，在lpc 干預HUVECs 的脂質化損傷的細胞模型中，在不增加細胞接種密度的條件下，通過調節lpc 干預體積，細胞存活率的變化範圍很大，可以從(17.19±1.82)％調節到(77.78±4.10)％，從而滿足不同的實驗目的和不同的實驗需求，同時也避免了單純依靠增加細胞接種密度提高細胞存活率時導致的對照組細胞出現過度生長抑制的現象，因此lpc 干預體積也可以作為調節細胞存活率的又一個有效參數。因此通過綜合調節lpc 濃度、細胞接種密度以及lpc 干預體積可以更加有助於製作一個滿足不同實驗需求的脂質化損傷的泡沫化細胞模型。
本實驗還發現再次脂質化損傷的內皮細胞存活率較初次脂質化損傷的細胞存活率明顯升高，而且差異有統計學意義，出現這種現象是否是因為在脂質化損傷的過程中內皮細胞對脂質損傷出現了預適應還是其他的分子機制，在今後的實驗研究中將會進一步探索。
[參考文獻]略
選自：《實用老年醫學》2018年5月第32卷第5期，系本平台首發，轉載請標明出處！
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