調控睡眠需求的分子機制—蛋白質磷酸化水平

大家好，今天給大家分享一篇發表在Nature上的文章，題目是「Quantitative phosphoproteomic analysis of the molecular substrates of sleep need」。日本筑波大學國際綜合睡眠醫學研究所劉清華教授課題組與Masashi Yanagisawa課題組以及Hiromasa Funato課題組合作發表的。

近幾年來，隨著神經科學相關研究手段的進步，鑒定了多個可調控睡眠的重要腦區，確認了一些重要的睡眠依賴性生物學功能，睡眠生物學得到了科學界越來越多的關注。但是，科學界對「Why do we sleep?」 這一問題的理解仍舊相當有限。經典的睡眠剝奪小鼠模型研究表明：小鼠睡眠剝奪後，作為睡眠需求的生化基礎的某種物質（睡眠需求物質）在腦內快速積累，導致小鼠進入睡眠後腦電圖的慢波活動增強，同時「睡眠需求物質」在睡眠中會逐漸消解。但是睡眠的內穩態調控系統的生物化學基礎是什麼？晝夜節律信號如何協同機體內穩態系統？這些問題仍有待回答。

在之前的研究中，Masashi Yanagisawa研究組等通過正向遺傳學篩選，在超過8,000隻隨機突變的小鼠中發現了一種睡眠遺傳學模型「Sleepy」。Sleepy是Sik3 (AMPK-related kinase)基因13號外顯子的5『剪接位點發生突變，並導致13號外顯子編碼的蛋白序列缺失的小鼠。Sleepy小鼠的睡眠時間顯著增加，慢波活動 (SWA, slow-wave activity) 顯著升高，但是其被喚醒反應(wake-promoting response)和晝夜節律行為(circadian rhythm) 正常。作者採用tandem mass tag （TMT）標記技術定量分析了Sleepy小鼠和經典的睡眠剝奪小鼠模型的蛋白質磷酸化水平， 研究結果表明睡眠剝奪6小時組的蛋白磷酸化程度顯著高於其它兩組，說明睡眠剝奪使大腦增加的極有可能就是蛋白磷酸化的程度。

在進一步研究中，作者使用了 「phosphorylation state change (?Ps) analysis」方法， 即對同一蛋白質上有統計學意義的磷酸化位點變化的程度進行加和，從而找到那些整體上磷酸化程度變化最大的蛋白。應用這個方法，作者終於發現了80個超磷酸化蛋白，並將其命名為「Sleep-Need-Index-PhosphoProteins (SNIPPs)」 蛋白。對這80個SNIPPs進行分析，發現69個可歸類於神經突觸蛋白，它們有些是神經突觸的結構蛋白，有些與神經遞質釋放有關，而且其中12個蛋白已報道證明其基因突變會導致小鼠或人類睡眠的異常，這些分析都提示SNIPPs整體或大部分可能是睡眠需求的分子基礎。另外，他們還發現通過腹腔注射MK801抑制NMDA受體會促使小鼠睡眠的慢波強度極大增加，這一過程也伴隨著SNIPPs蛋白磷酸化水平的升高。

以上實驗均說明了腦內蛋白磷酸化水平，尤其是SNIPPs蛋白的磷酸化水平的逐漸積累，與睡眠需求的積累是正相關的。

最後，作者嘗試應用Sik3的特異性抑製劑HG-9-91-01抑制SLEEPY的蛋白激酶活性。發現在腦室注射HG-9-91-01後，可以抑制sleepy小鼠中的SLEEPY活性， SNIPPs蛋白磷酸化水平也有所降低，同時顯著降低了sleepy小鼠慢波睡眠活動。在野生型小鼠睡眠剝奪過程中，腦室注射HG-9-91-01，亦發現腦內的SNIPPs磷酸化程度和睡眠需求（慢波）強度降低，這些結果都說明SNIPPs的磷酸化程度在睡眠內穩態調控中起到重要作用。作者推測清醒狀態下的活動促使SNIPPs 蛋白的磷酸化水平特異性的升高，其磷酸化的程度決定了清醒過程持續的時間和清醒程度；SNIPPs蛋白磷酸化水平的變化伴隨著其蛋白質功能上的改變和睡眠需求的積累，從而決定了後續睡眠的質量和持續時間。而睡眠本身則提供了特異的機制促使SNIPPs蛋白去磷酸化，同時起著修復大腦損傷、參與記憶的形成和鞏固過程。

總之，作者通過蛋白組學的方法從「磷酸化/去磷酸化循環調控」角度提出了睡眠分子調控的新理論，為理解神經突觸穩態及睡眠穩態機制提供了重要基礎。

本文作者：TH

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