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拮抗菌SJ1616發酵上清液和9種化學殺菌劑對玉米小斑病菌的抑制活性研究

摘要:為探究拮抗菌SJ1616發酵上清液和9種化學殺菌劑對玉米小斑病菌的抑制活性。採用菌絲生長速率法,測定了種子液不同菌齡、發酵時間對抑菌物質產生的影響以及9種化學殺菌劑對病菌的抑制效果。拮抗菌SJ1616種子液最佳培養時間為4 h,發酵時間最適為72 h。玉米小斑病菌對咪鮮胺、戊唑醇、丙環唑和腐霉利的敏感性較高,其中咪鮮胺對病菌的抑制活最高,EC50達0.422 μg/mL;而福美雙對病菌的抑制活性較差,EC50為21.426 μg/mL。本研究可為玉米小斑病的防控提供理論依據。

關鍵詞:玉米小斑病;拮抗菌;殺菌劑;發酵液;毒力

玉米小斑病(Bipolaris maydis)是世界玉米栽培中普遍發生的病害,在我國主要分布於黃河流域、長江流域等溫暖潮濕地區。玉米小斑病的發病時期廣、危害範圍大,尤以抽雄後玉米葉片上發生最為嚴重[1]。目前對於玉米小斑病的防治主要通過農業防治減少病源配合化學防治實現田間控制的方法,主要停留在化學防治階段,而市場上缺乏針對玉米小斑病的高效藥劑[2]。農業防治的防治效果有限,玉米小斑病嚴重發生的抽穗灌漿期植株較大,化學防治時施藥不便。生物防治成了最有潛力的防治方法。而目前有研究的生防菌主要是細菌和放線菌[3]。本研究採用菌絲生長速率法,對拮抗菌SJ1616發酵上清液和9種化學殺菌劑進行測定,旨在闡明生防菌發酵液和常見化學殺菌劑對玉米小斑病菌的抑制效果,為生產玉米小斑病的的可持續治理提供理論依據和技術支持。

1材料與方法


95%(百分含量,w)苯醚甲環唑原葯(山東億嘉農化有限公司);96%(w)咪鮮胺原葯96%(w)戊唑醇原葯(山東華陽農藥化工集團有限公司);50%(w)腐霉利可濕性粉劑(日本住友化學株式會社);75%(w)代森錳鋅可濕性粉劑(上海禾本葯業有限公司);50%(w)福美雙可濕性粉劑(南通寶葉化工有限公司);70%(w)丙森鋅可濕性粉劑(拜耳作物科學有限公司);95%(w)嘧菌酯原葯(山東濰坊潤豐化工股份有限公司);95.58%(w)丙環唑原葯(江蘇豐登作物保護股份有限公司)。殺菌劑原葯採用丙酮溶解,配製成1.0×104 μg·mL-1的母液置於4℃冰箱中保存備用;製劑用滅菌水溶解,現配現用。


供試病原菌為玉米小斑病菌(Bipolaris maydis),由安徽科技學院農學院作物學實驗室保存並提供。


PDA培養基:土豆200.00 g,葡萄糖20.00 g,瓊脂15.00 g,去離子水1.00 L;

NA培養基:牛肉浸膏3.00g,酵母浸膏1.00g,蛋白腖5.00g,葡萄糖10.00 g,瓊脂15.00 g,去離子水1.00 L。(可不加瓊脂製成NB培養基)。


菌株SJ1601、SJ1606、SJ1610、SJ1613、SJ1616、SJ1620、SJ1623分別在製成的NA培養基上劃線培養48h。挑取單菌落菌苔接入裝有8mLNB培養液的試管(180mm×18 mm)中,以33℃、140r·min-1搖床培養12h作為種子液。吸取0.25mL SJ1616發酵上清液,接入49.75mLNB培養基的250mL三角瓶中,以33℃、140r·min-1的恆溫搖床中培養84h,培養結束後以10000r·min-1,4℃離心20min,經0.22μm濾膜過濾後保存於4℃冰箱備用。然後採用菌絲生長速率法測定製備好的發酵上清液的400倍稀釋液對玉米小斑病菌的抑制活性,計算抑制率,篩選出抑制效果最佳的進行後續研究。


按照1.2.1的方法獲取接種液後,吸取0.25mL置於裝有49.75mLNB培養基的三角瓶中,並在33℃、140r·min-1的恆溫搖床中分別培養4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h,於各個時間段培養結束後取出,按照1 .4.1的方法離心獲取菌體,用無菌水洗滌菌體3次後再用無菌水重懸,用分光光度計調至菌液OD600=1.0,吸取0.25 mL種子液接入到裝有49.75mLNB液體培養基的三角瓶中,搖床培養72 h後,採用2.6.1的方法離心,製得發酵上清液保存於冰箱中。將不同菌齡的發酵上清液稀釋400倍並接種玉米小斑病培養144h後測定發酵上清液的抑制活性。


按照1.2.2的方法獲取種子液後,置於33℃,140r·min-1的恆溫搖床中,分別培養24 h、48 h、60 h、72 h、84 h和96 h,培養結束後採用2.6.1的方法離心,測定不同培養時間的發酵上清液對玉米小斑病菌的抑制活性。


在9種化學殺菌劑對玉米小斑病預實驗的基礎上將其按表1的要求由高到低配成6個濃度,再以一組為對照,加入無菌水。在無菌條件下,用移液槍吸取5L放入裝有44mLPDA培養基的三角瓶中,,搖晃至均勻後倒入三個培養皿中冷卻備用,每濃度6皿。接入菌齡3 d的玉米小斑病菌菌餅,密封放入28℃恆溫培養箱中培養6 d後測量菌落直徑並計算抑制率。

表1 9種化學殺菌劑濃度設置

Table1 Concentration gradient of 9 fungicides


抑菌率(%)=(對照菌餅直徑-處理菌餅直徑)/(對照菌餅直徑-7)×100%


所有數據採用EXCEL和SPSS20.0進行統計分析。

2結果與分析

由表2可知,參與篩選的7株拮抗細菌中,SJ1616對玉米小斑病菌的抑制活性最高,達82.31%,SJ1601和SJ1610對玉米小斑病的抑制效果次之,分別為78.08%和79.26%。因此,選用抑制效果最高的SJ1616為玉米小斑病菌的優勢拮抗菌開展後續研究。

表2 7株拮抗細菌發酵上清液對玉米小斑病的抑制效果測定

Table 2 Inhibitory activity of 7 antagonisticbacteria fermentation supernatants toBipolarismaydis


由圖1可知,隨著菌齡的不斷升高,拮抗菌SJ1616的發酵上清液對玉米小斑病菌的抑制活性不斷降低,種子液菌齡為4h製得的發酵上清液對對玉米小斑病菌的抑制效果最佳達83.70%。這說明菌齡對拮抗菌產生抑菌活性物種具有重要的影響,推測菌齡越大菌體活性越弱,產生抑菌活性的物質也逐漸減少。因此,在既定培養條件下,確定4h為拮抗菌SJ1616的最適菌齡。

圖1不同菌齡的發酵上清液對玉米小斑病菌的抑菌活性測定

Fig.1 Inhibitory activity of the supernatant ofantagonistic bacteria SJ1616 at different ages to

Bipolarismaydis


由圖2可知,隨著培養時間的的增長,發酵上清液對玉米小斑病菌的抑制活性先上升後下降,72h抑制率達到最大為84.52%。由此可見抑菌活性物質的產生需要適宜的培養時間,培養時間較短時,發酵液中的菌體數量較少,抑菌活性物質含量較低;時間過長,發酵上清液對病菌的抑菌活性也降低,推測抑菌活性物質由於受到死亡菌體的吸附和負反饋調節作用而導致含量下降。

圖2拮抗細菌SJ1616不同培養時間發酵上清液對玉米小斑病菌的抑菌活性測定

Fig. 2 Inhibitory activity of the supernatant ofthe antagonistic bacteria SJ1616 at different culture time toBipolaris maydis

由表3可知,三唑類殺菌劑咪鮮胺、丙環唑、戊唑醇和苯醚甲環唑對玉米小斑病的抑制效果比較好,EC50分別是0.42mg/L、0.67mg/L、0.68mg/L和1.71mg/L。二甲醯亞胺類殺菌劑腐霉利EC501.21mg/L,甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯和保護性有機硫殺菌劑丙森鋅、代森錳鋅以及福美雙對病菌的EC50分別為4.17mg/L、4.26mg/L、12.91mg/L和21.43mg/L。

表3 9種殺菌劑對玉米小斑病菌的室內毒力測定結果

Table 3 Indoor virulence of 9 fungicides againstBipolaris maydis

3結論與討論

玉米小斑病是玉米上的常見多發病害,小斑病無性態為玉蜀黍雙極蠕孢(Bipolaris maydis),為無性真菌類雙極蠕孢屬成員[1]。玉米小斑病菌具備生理分化現象,根據不同細胞質玉米的專化性,分為T、S、C和O共4個生理小種,因此很難防治[4-5],生產上玉米小斑病的防治主要以化學防治為主,單一的依靠化學防治並不是如今國家所倡導的防治措施,生物防治研究備受青睞。通過研究可以看出,拮抗菌SJ1616對玉米小斑病菌有優異的抑制效果,SJ1616主要通過產生脂肽類抗生素和抗菌蛋白等活性物質而發揮抑菌作用[6-7]。謝蘭芬[8]等的研究表明,解澱粉芽孢桿菌Y2發酵液對玉米小斑病菌的抑制效果達88.04%,並系統測定了拮抗菌對玉米小斑病各個接種時期的防治效果,得出預防效果大於治療效果的結論。本研究所涉及拮抗菌SJ1616對玉米小斑病菌抑制效果優異,但後期還需開展大量盆栽和田間防效試驗[9]。甘林等[5]的研究表明,咪鮮胺的EC50在0.0053~7.930ug/mL之間,本研究所得的咪鮮胺的EC50值也在該區間內。但可以看出,EC50最高值為最低值的1490.6倍,推測不同地區的小斑病菌對化學殺菌劑的敏感性具有較大差異。因此,應加強不同地區玉米小斑病的抗藥性監測研究,以加強藥劑防治小斑病的針對性[10]。針對化學殺菌劑的諸多缺點,如污染環境、抗藥性的產生等等,發展生物農藥符合我國的植保需求,從拮抗菌中獲取發酵活性物質是一個重要途徑。由於化學殺菌劑普遍被農民所接受,如今還不能做到完全脫離化學殺菌劑,因此可將化學藥劑與生物農藥相混配,以達到最好的防治效果[11,12]。

致謝

本論文是在段海明老師的悉心指導下完成的。同時也要感激我的家人以及朋友們對於我的支持,讓我能安心的進行實驗。

參考文獻:

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Studyon the Inhibitory Activity of Antagonistic Strain SJ1616 FermentationSupernatant and 9 Chemical Fungicides against Alternaria brassicae

Student majoringin Agronomy educationChu Yiming

TutorDuan Haiming


Abstract:Toinvestigate the inhibitory activity of antagonistic bacteria SJ1616fermentation supernatant and nine chemical fungicides againstAlternaria brassicae. Mycelial growthrate method, The effect of different bacteria age and fermentation time on theantibacterial substances and the inhibitory effect of 9 kinds of chemicalbactericides on pathogens were determined. The optimal culture time ofantagonistic bacteria SJ1616 seed fluid was 4 h, and the optimum fermentationtime was 72 h. Rhizoctonia solani showed high sensitivity to prochloraz,tebuconazole, propiconazole, and procymidone, with prochloraz most inhibitingbacteria. The EC50was 0.422 μg/mL; the thiram was less inhibitoryto the bacteria with an EC50of 21.426 μg/mL. This study can providea theoretical basis for the prevention and control of corn leaf spot disease.

Keywords:Corn leaf spot;fungicides; antagonistic bacteria; fermentation broth.

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