張翀：利用混合CRISPR干擾技術實現細菌全基因組水平功能基因的高效研究

近年來隨著測序技術的發展，細菌基因組的基因序列信息呈現爆炸式增長，然而，與之相對應的基因功能研究卻因缺乏高通量低成本的研究手段而相對滯後。目前有三類方法可以實現細菌全基因組水平基因功能的研究，即單基因敲除菌株陣列法（Arrayed Collection of Single-Gene Deletion Strains），可追溯多元基因編輯法（Trackable Multiplex Recombineering, TRMR）和隨機轉座子插入法（Random Transposon Insertion-Derived Gene Knockout, Tn-seq），但前兩種方法通常只能在模式菌株中實現，第三種方法無法實現靶向設計。近日清華大學張翀團隊通過CRISPR干擾技術實現細菌全基因組水平功能基因的高效研究，該文章發表在Nature Communications雜誌上。

圖1. 混合CRISPR干擾技術總體框架

CRISPR干擾技術在真核生物中已經取得了諸多成功，並已有研究總結出真核生物CRISPR干擾中sgRNA的設計原則，但這些原則在細菌中是否有效尚沒有報道。在本研究中，張翀教授團隊首先通過對2281個針對已知功能基因的sgRNA在CRISPR干擾中工作效率的探究，總結細菌中sgRNA設計原則，包括針對每個基因設計15個sgRNA可以實現穩健的基因沉默，每個ORF的前5%的序列應儘可能多的設計sgRNA，多拷貝基因簇可在同源區設計sgRNA等。通過CRISPR干擾技術與Tn-seq方法的比較可以發現，在類似文庫規模條件下，CRISPR干擾技術假陽性率更低，能夠捕獲更多的已知必需基因，且對於編碼區域短的基因，CRISPR干擾技術的優勢更加明顯。

圖2.通過CRISPR干擾技術預測大腸桿菌必需基因

CRISPR干擾技術具有廣泛的應用價值，除了研究細菌必需基因外，還可以研究細菌ncRNA編碼基因，解析細菌代謝的基因網路，鑒定有毒化學物質抗性基因等。研究團隊還開發出相關軟體包以方便細菌CRISPR干擾技術的sgRNA的設計。

圖3.利用CRISPR干擾技術解析大腸桿菌氨基酸合成代謝網路

點評：

CRISPR-Cas9基因編輯過程中會造成DNA雙鏈的斷裂，因此不適合用於多元基因編輯中，但本文作者巧妙的運用CRISPR基因干擾技術，在不切割DNA的前提下保留了CRISPR系統的高效性和普適性，實現了細菌全基因組水平的基因功能的高效研究。

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WangT, Guan C, Guo J, et al. Pooled CRISPR interference screening enables genome-scalefunctional genomics study in bacteria with superior performance. NatureCommunications, 2018, 9:2475.

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