桐樹生物報道適合於東亞結直腸癌患者的MSI檢測位點新研究

近日，國際腫瘤期刊《Future Oncology》發表的一篇題為「The clinicopathological features and prognosis of tumor MSI in East Asian colorectal cancer patients using NCI panel」文章，通過對東亞結直腸癌（CRC）患者不同MSI檢測位點進行對比，確定出最佳MSI檢測Panel，並對東亞結直腸癌MSI發生率，臨床病理特徵及預後的相關性進行分析總結。該研究由上海桐樹生物科技及相關2家臨床科研機構共同完成，為MSI（微衛星不穩定性）在結直腸癌患者的診斷、臨床病理特徵及預後意義等方面提供重要的臨床指導意義。

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本文研究人員採用兩種不同檢測位點測定MSI，並結合MMR蛋白免疫組化實驗和多元變數分析，探究東亞CRC患者MSI的發生狀況及臨床病理特徵及預後的相關性，研究主要得到以下發現：

●東亞CRC患者MSI發生率略低於歐美人群，人群種族及基因多態性的不同，導致微衛星重複系列存在差異。

●單核苷酸+雙核苷酸聯合Panel敏感性高於單純單核苷酸Panel，對於東亞裔CRC患者MSI的檢測，單核苷酸+雙核苷酸聯合Panel更適合。

●東亞裔MSI的臨床病理特徵與歐美人群基本一致，MSI-H好發於二期，近端、右半結腸部位，且分化較差伴有粘液成分的CRC患者。

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研究背景

結直腸癌（CRC）是最常見的惡性腫瘤之一，據統計，全球每年約有 120 萬名患者被確診為結直腸癌，而有超過 60 萬名患者直接或間接死於結直腸癌。因此，結直腸癌已成為現階段威脅人類健康的重要疾病之一。近年來，隨著分子生物學及相關基因組學的發展，人們發現MSI在CRC的精準診斷和治療中扮演者極其重要的角色，如對CRC預後進行判斷，指導5-氟尿嘧啶、伊立替康等化療藥物的反應，幫助診斷篩選Lynch綜合征等，MSI已成為結直腸癌預後和臨床輔助治療過程中一個重要分子標誌物。

對於結直腸癌MSI的檢測，早在2004年，美國國立癌症研究中心（NCI）頒布了貝塞斯達（Bethesda）標準，該標準在MSI檢測位點的選擇上規定了兩種方式：2個單核苷酸（BAT-25、BAT-26）+3個雙核苷酸（D5S346、D2S123、D17S250）聯合位點的NCI Panel或者5個單核苷酸（BAT-25、BAT-26、NR21、NR22、NR24）單純位點的Pentaplex Panel。儘管這兩種Panel均能準確的檢測MSI，但經比較發現，二者在檢測內對照設置、MSI-L精準篩查、MSI判定標準等方面仍存在一定的差異和優劣勢。近年來，隨著MSI相關研究的不斷深入，有研究報道針對東亞裔CRC患者MSI表型檢測採用2個單核苷酸+3個雙核苷酸的聯合Panel可能更為適合，但這種觀點需要進一步的研究證實。為此本研究以東亞裔CRC患者為研究對象，採用兩種不同的位點對MSI進行檢測，並採用MMR蛋白免疫組化對兩種方法進行評估，旨在為MSI的檢測、臨床病理及預後提供一定的理論依據。

研究方法

本研究以245例東亞結直腸癌患者為研究對象，其中直腸癌62例，左半結腸癌107例，右半結腸癌40例，其他類型（包括橫結腸癌、橫結腸-乙狀結腸癌、乙狀結腸癌等）36例。

採用PCR和IHC對患者MSI和MMR蛋白進行檢測，在PCR檢測MSI過程中，位點選擇採用NCI Panel 和Pentaplex Panel兩種檢測方法對患者的MSI進行檢測，並用免疫組化實驗評估MMR蛋白表達與兩種Panel檢測MSI間的一致性，同時通過多元變數分析MSI-H與臨床病理特徵及相關基因突變信息的相關性，以此為CRC臨床診斷及預後評價提供更為完善的參考價值。

研究結果

1. MMR蛋白表達與MSI的相關性比較

目前，MMR蛋白的免疫組化分析（IHC）已成為臨床上檢測MSI的一種常用方法，通過檢測MLH1、MSH2、PMS2及 MSH6 4種蛋白表達，當4種蛋白均為陽性時，則判讀為MMR-I（MMR蛋白完整），如果其中一個蛋白表達缺失則判讀為MMR-D（MMR蛋白缺失）。本研究通過採用IHC對患者4種蛋白檢測，發現共有28例患者為MMR-D，這28例患者12例（42.9%）為1個蛋白缺失，16例患者（57.1%）為兩個蛋白缺失。

對於MSI表型的檢測，我們分別採用NCI Panel和Pentaplex Panel兩種方法進行檢測。在NCI Panel 檢測中我們發現有27例患者（11%）為MSI-H表型，2例患者（0.8%）為MSI-L表型，剩下216例患者（88.2%）為MSS表型；相比對於Pentaplex Panel檢測，結果顯示23例患者（9.4%）為MSI-H表型，1例患者（0.4%）為MSI-L表型，221例患者（90.2%）為MSS表型。值得注意的是，兩種方法均發現BAT-25、BAT-26是所有檢測位點中最不穩定的，檢測靈敏度均大於75%，如圖1。

圖1 兩種方法檢測5個MSI標記位點的靈敏度和特異性

2. 不同方法測定MSI狀態的一致性比較

通過比較NCI Panel和Pentaplex Panel兩種方法的靈敏度和特異性（見表1），結果發現NCI Panel檢測的敏感性高於Pentaplex Panel檢測的敏感性，這提示NCI Panel檢測可能更適合於東亞裔患者。

表1 微衛星標記在無錯配修復蛋白表達檢測中的預測值

採用MMR IHC對兩種Panel進行評估（見表2，表3），結果發現，與Pentaplex Panel相比，NCI Panel與dMMR的一致性可能更高（Kappa值0.898），這表明NCI Panel檢測能更好的反映MMR蛋白表達。

表2 免疫組化檢測MMR蛋白表達與NCI Panel檢測MSI間的一致性

表3 免疫組化檢測MMR蛋白表達與五個單核苷酸重複系列檢測MSI間的一致性

3. MSI-H與臨床病理特徵

對於MSI-H與非MSI-H的患者進行比較，發現MSI-H患者與腫瘤分級、右側腫瘤位置、粘液組織類型相關，與患者年齡、TNM分期、BRAF突變、淋巴結轉移不相關。

4. MMR蛋白表達、MSI狀態與結直腸癌預後

本研究對245名患者進行為期24個月的隨訪，結果發現MSI-H患者相比MSS / MSI-L患者有更長的無病生存期（DFS）（圖2），同樣，MMR蛋白表達缺失（MMR-D）患者較MMR蛋白表達完整（MMR-I）患者表型有有更長的無病生存期（DFS）。以上結論表明MMR-D和MSI-H是CRC患者的兩個獨立預後因素。

圖2 MSI表型與患者DFS間關係

結論

MSI是CRC診斷和治療領域中一個非常重要的生物標記物，可準確反映CRC病理學特徵，同時對CRC的治療如5-氟尿嘧啶化療響應也能提供一定的指導，本研究採用兩種不同的方法對MSI進行檢測比較，並分析MMR蛋白表達、MSI-H與結直腸癌預後間的關係，得到以下結論：

（1） 本研究採用NCI Panel對東亞CRC患者MSI進行檢測，發現MSI-H約佔11%，這一比例較歐美CRC患者（MSI-H約8-20%）略低，這可能與獨特的臨床病例特徵，種族差異及基因多態性相關。

（2） 採用NCI Panel 、Pentaplex Panel對MSI進行檢測，其中NCI Panel檢測分析靈敏度似乎更高，同時與IHC測得的MMR比較，NCI Panel檢測的一致性也更好，這可能與兩種方法的內對照，cut-off值及MSI發生核苷酸位點相關。

（3） 本研究再次證實MSI對CRC患者的預後有一定的指導意義，尤其是MSI-H患者，其無病生存期（DFS）較MSS/MSI-L患者更長，因此MSI-H是CRC治療預後的一個有效的標誌物。

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