宏基因組學：照亮整個微生物世界

最近三十年，組學研究一直是熱點。最早火起來的是基因組學，然後是蛋白質組學。如今，最有前途的新興組學領域是宏基因組學（metagenomics）。這個學科是對土壤、糞便和水等樣本中的整個微生物群落進行研究。

通過這種研究，人們有望為多個領域提供新穎的研究思路，比如對付抗生素耐藥性。早前，我國學者曾經開展一項研究，對17個主要城市的32個污水處理廠的樣本開展宏基因組分析，發現了381個在各大城市都普遍存在的抗生素耐葯基因。這表明可以通過監控污水系統來加強抗生素的管理工作。

當然，宏基因組學十分複雜。與人體或動植物的基因組或蛋白質組不同，微生物群落龐大且複雜，因此不能全部測序，只能抽樣。據宏基因組學先驅、加州大學聖地亞哥分校的Rob Knight教授介紹，地球上的微生物超過10的30次方，這個數字比宇宙中已知恆星的數量還要高九個數量級！

樣本採集

「這個領域的主要挑戰之一是樣本採集和記錄這一整套過程的標準化，」Synthetic Genomics的生物信息學副總裁Toby Richardson說。「舉個例子，人體的典型樣本是糞便。那麼，什麼時候取樣？如何從取樣地點轉移到分析地點？」

宏基因組學領域的專家、美國馬里蘭大學的著名教授Rita Colwell也同意這個觀點。「在宏基因組學研究中，人們往往忘記了需要有統計學意義的樣本。只有一個樣本，就得出重要結論，這是相當危險的。以水來說吧。你是過濾一毫升、十升、一百升，還是一千升？」

DNA/RNA分離

至於DNA分離的標準化，目前也存在挑戰。「每個樣本都是獨一無二的。土壤和糞便樣本在處理方法上就有很大差異，你必須嘗試不同的試劑盒，才能找出最有效的提取方法，」Richardson說。

德國的Machery-Nagel公司就開發出一些專門的RNA分離試劑盒。「我們為環境樣本而開發的試劑盒包含洗滌液，能夠沖走腐殖酸，」該公司的產品經理Andreas Hecker談道。「我們的糞便試劑盒還包含抑製劑去除柱，將裂解液加在上面並離心，它就能去除抑製成分，還能過濾未裂解的組分。這個步驟只需要一分鐘。」

樣本勻漿也使得土壤和糞便樣本的製備變得複雜，因為它們含有大量難以破碎的組織。Macherey-Nagel的大多數環境試劑盒都帶有NucleoSpin Bead Tube。這個2 mL的管中含有玻璃珠、陶瓷珠或金剛砂，或者是它們的混合物，能夠機械破碎各種樣本。Hecker指出，「玻璃珠適用於細菌，陶瓷珠適合土壤和糞便樣本，而植物材料最好用金剛砂。」

在樣本勻漿之後，最常見的分析方法就是擴增和分析16S核糖體RNA（rRNA）基因。「16S rRNA基因在細菌中高度保守，通過它來尋找樣本中存在哪些物種是一個不錯的選擇，」Richardson說。

「到目前為止，我敢說已發表論文中高達80-90%的宏基因組數據都使用了16S。不過這存在某些固有的偏倚。每個物種可能有多個16S拷貝，因此除非對數據進行均一化處理，否則難以進行定量分析，」他說。

新一代測序

專家認為，16S分析也許會在某一時刻被新一代測序所取代。Rita Colwell教授表示：「最初，大多數人都對16S的結果感到滿意，但現在NGS的結果更激動人心。不過，我們正處在起步階段，一些標準化的東西必須被開發出來。這將加速FDA批准新一代測序作為一種工具。」

目前，有許多開源工具可用於高通量16S RNA測序研究的分析。MG-RAST伺服器提供了序列片段的注釋、系統發育分類、樣本的功能分類，以及多個宏基因組之間的比較。 Knight博士的QIIME讓用戶可以將Illumina或其他供應商平台上生成的原始測序數據轉換成出版級別的圖形和統計數據。

Richardson認為，測序和組裝都很便宜，但注釋將成為瓶頸。他表示，Synthetic Genomics擁有的技術將加速這一過程。這家公司最近組裝了一個高達47 Gb的微生物組數據集，比目前發表的數據都要大。以往，注釋過程可能需要幾個星期。現在有了深度學習和人工智慧，他們能夠在一小時內完成注釋，只需幾百美元。

現場工作

當然，宏基因組學研究還需要一些可以從實驗室搬到現場的工具。CosmosID 公司的副總裁Nur Hasan 表示：「我們需要一些用戶友好的工具，讓那些沒有接受過培訓的普通生物學家也能開展大規模分析。比如，當疫情爆發時，我們需要快速確定病原體是來自食物、水還是醫院傳播。」

CosmosID正在開發此類解決方案。「你需要快速分型，但眼下這項工作太費時，除非你聘請一名生物信息學家，並擁有相關設施。我們正在建立一個宏基因組資料庫，並開發經過驗證的演算法，為快速的流行病學分型提供簡便的工具，」Hasan說。

根據Colwell博士的預測，在未來五年內，手持式的宏基因組測序設備有望在醫院等地使用，讓即時診斷成為現實。「Illumina無疑也在為此而努力。回想40、50年前，我開發出第一個計算機程序來分析微生物分類數據，那是多麼乏味的事情。現在，我們只需要一台筆記本電腦就搞定了。未來是值得期待的，」她說。

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