PNAS：中國學者首次解析草魚呼腸孤病毒內部聚合酶複合物和核酸的三維結構

導 讀

草魚呼腸孤病毒（GCRV）是我國分離鑒定的第一株魚類病毒，擁有自主知識產權，也是國際上研究得最為系統的水生動物呼腸孤病毒。近日，中國科學院武漢病毒研究所方勤研究員與湖南師範大學劉紅榮教授及清華大學生命科學學院程凌鵬副研究員等人合作，在國際上首次解析了雙層二十面體衣殼草魚呼腸孤病毒內部聚合酶複合物和核酸的三維結構，為進一步闡明雙鏈RNA病毒內部結構及病毒複製和轉錄機制提供了豐富的結構信息。相關研究於2018年6月25日在線發表於美國科學院院刊PNAS（Proceedings of the NationalAcademy of Sciences, USA）上，題為 「Structureof RNA polymerase complex and genome within a dsRNA virus provides insightsinto the mechanisms of transcription and assembly」。

Fig. 1. Structures of the aquareovirus genome and RdRp complex within the capsid (filtered to 8-? resolution).

研究背景

病毒三維結構研究已有50多年，之前的研究僅聚焦在病毒外部二十面體對稱衣殼蛋白結構，而其內部核酸結構通常被認為是柔性無固定結構。

2015年劉紅榮與程凌鵬在國際上首次解析並報道了單層衣殼的雙鏈RNA基因組的呼腸孤病毒科病毒CPV內部基因組及相關蛋白結構（Sciences，2015，Vol）349.1347-1350）。

草魚呼腸孤病毒（GCRV）為我國分離鑒定的第一株魚類病毒，擁有自主知識產權，也是國際上研究得最為系統的水生動物呼腸孤病毒。本研究在國際上首次解析了雙層二十面體衣殼草魚呼腸孤病毒內部聚合酶複合物和核酸的三維結構，為進一步闡明雙鏈RNA病毒內部結構及病毒複製和轉錄機制提供了豐富的結構信息。

結果速覽

本研究利用200kV加速電壓的冷凍電鏡與對稱失配三維重構技術，解析了水生呼腸孤病毒/草魚呼腸孤病毒近原子分辨的完整結構，包括病毒顆粒外部雙層二十面體對稱的衣殼和衣殼內部非二十面體對稱的聚合酶、輔助蛋白及病毒核酸結構，精確闡述了聚合酶及其複合物與核酸、衣殼蛋白之間複雜的相互作用及精細的結構信息，研究了該病毒衣殼蛋白通過構象變化來協調聚合酶的複製與轉錄狀態切換的機制。

該工作是目前所報道的用200kV電鏡獲得的尺度最大的生物大分子複合物的近原子解析度結構（由1500多個蛋白聚合成的超過800A直徑的顆粒，最好的區域結構解析度為3.1A）

Fig. 2. Structures of VP2, VP4, and VP3A.

研究表明呼腸孤病毒科病毒的RNA聚合酶和基因組排列為一個不完整的二重三次對稱，其雙鏈RNA分層狀排列，相鄰的RNA平行排列。本研究進一步否定了近二十年來佔據雙鏈RNA病毒研究領域的「病毒衣殼內的RNA基因組和聚合酶呈線軸狀排列」這一主流觀點，為闡明雙鏈RNA病毒的複製和轉錄的分子機制提供了結構基礎。

結 語

本研究在國際上首次解析了雙層二十面體衣殼草魚呼腸孤病毒內部聚合酶複合物和核酸的三維結構，為進一步闡明雙鏈RNA病毒內部結構及病毒複製和轉錄機制提供了豐富的結構信息。本研究得到了國家自然科學基金委及病毒學國家重點實驗室開放課題等項目資助。中國科學院武漢病毒研究所方勤研究員、湖南師範大學劉紅榮教授及清華大學程凌鵬研究院為本文的通信作者，湖南師大研究生王勖榮、中科院武漢病毒所助理研究員張付賢為本文共同第一作者。

ABSTRACT

Most double-stranded RNA (dsRNA) viruses transcribe RNA plus strands within a common innermost capsid shell. This process requires coordinated efforts by RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) together with other capsid proteins and genomic RNA. Here we report the near-atomic resolution structure of the RdRp protein VP2 in complex with its cofactor protein VP4 and genomic RNA within an aquareovirus capsid using 200-kV cryoelectron microscopy and symmetry-mismatch reconstruction. The structure of these capsid proteins enabled us to observe the elaborate nonicosahedral structure within the double-layered icosahedralcapsid. Our structure shows that the RdRp complex is anchored at the inner surface of the capsid shell and interacts with genomic dsRNA and four of thefive asymmetrically arranged N termini of the capsid shell proteins under the fivefold axis, implying roles for these N termini in virus assembly. The binding site of the RNA end at VP2 is different from the RNA cap binding site identified in the crystal structure of orthoreovirus RdRp λ3, although the structures of VP2 and λ3 are almost identical. A loop, which was thought to separate the RNA template and transcript, interacts with an apical domain of the capsid shell protein, suggesting a mechanism for regulating RdR preplication and transcription. A conserved nucleoside triphosphate binding site was localized in our RdRp cofactor protein VP4 structure, and interactions between the VP4 and the genomic RNA were identified.

參考文獻：

1. Xurong Wang, FuxianZhang, Rui Su, Xiaowu Li, Wenyuan Chen, Qingxiu Chen, Tao Yang, Jiawei Wang,Hongrong Liu, Qin Fang, and Lingpeng Cheng.Structure of RNA polymerase complexand genome within a dsRNA virus provides insights into the mechanisms oftranscription and assembly.PNASJune 25, 2018. 20180388.

2.中科院武漢病毒所官網：

武漢病毒所研究獲得草魚呼腸孤病毒衣殼內部的核酸和聚合酶複合物結構http://www.whiov.ac.cn/kyjz_105338/201807/t20180704_5037344.html

本期編輯：Annabella

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