中科院微生物研究所吳邊課題組發表Nat Chem Biol論文：人工設計新型酶分子，實現自然界未曾發現的催化反應

現代生物製造已經成為全球性的戰略性新興產業，隨著高性能計算技術迅猛發展，新型綠色生物製造技術不斷推動產業創新鏈條升級、換代與更迭，尤其是在核心元件蛋白質的設計方面，發揮了巨大的作用，蛋白質的工程改造正在經歷從傳統實驗進化到計算機虛擬設計的演變過程。計算機輔助蛋白結構預測以及新功能酶設計可以極大地擴展人工改造生命體的應用場景，變革性地推動綠色生物製造的發展。

近期，中國科學院微生物研究所吳邊團隊通過計算機輔助設計，構建出一系列的新型酶蛋白，實現了自然界未曾發現的催化反應；並在世界上首次通過完全的計算指導，獲得了工業級微生物工程菌株，取得了高性能計算設計驅動生物製造在工業化應用層面的率先突破。相關成果發表在Nature Chemical Biology雜誌上。

β-氨基酸是一大類非蛋白質氨基酸，被應用於食品、農牧業以及重要活性天然產物和藥物合成等多個產業。但是β-氨基酸合成主要依賴於過渡金屬催化，需要昂貴的催化劑、繁瑣的保護與去保護步驟以及苛刻的反應條件，為環境帶來了巨大的壓力。因此，設計β-氨基酸的新型綠色合成途徑成為了合成領域的一項重大挑戰。面向這一挑戰，作者選擇了碳-碳雙鍵的不對稱氫胺化路徑進行研究。在尋找可以高效催化α,β-不飽和羧酸發生β-氫胺化反應的原型酶時，作者選中了芽孢桿菌天冬氨酸酶AspB（UniProt Q9LCC6）。這個酶不需要輔因子就能可逆地催化天冬氨酸生成延胡索酸和氨。

圖1. 天冬氨酸酶AspB可逆裂解天冬氨酸

從圖2所展示的天冬氨酸和AspB的詳細相互作用模式，作者認為天冬氨酸含有兩個羧酸基團，在保持與β-羧酸基團作用的蛋白口袋殘基不變，同時改變與α-羧酸基團作用的蛋白口袋殘基，經這樣改造後的天冬氨酸酶就可能催化其他的α,β-不飽和羧酸和β-氨基酸。

圖2. a)天冬氨酸與天冬氨酸酶AspB的相互作用模式（PDB 3R6V）和b)與不同基團相互作用的蛋白口袋

作者總共設計了5類改造酶，其底物分別是脂肪氨基酸（β-氨基丁酸和β-氨基戊酸）、極性氨基酸（β-天冬醯胺）和芳香氨基酸（β-苯基丙氨酸）。為了設計生成不同β-氨基酸的改造酶，需要根據底物周圍殘基的物理化學性質合理地制定殘基的突變策略。由於Asn142和His188是離去氨的催化酸供體殘基，因此不予以突變。

1)脂肪氨基酸設計路線：β-氨基丁酸和β-氨基戊酸的疏水基團區別於天冬氨酸，需要α-羧酸基團結合口袋（Thr187、Met321、Lys324和Asn326）突變為疏水氨基酸口袋。

2)極性氨基酸設計路線：雖然β-天冬醯胺與天冬氨酸相似，但是天然天冬氨酸酶AspB對β-天冬醯胺沒有反應活性。在設計能催化β-天冬醯胺時，改造酶的α-羧酸基團結合口袋的Lys324要突變為可接觸到底物的極性氨基酸，α-羧酸基團結合口袋的其他三個殘基隨機突變為任意的20個氨基酸。

3)芳香氨基酸設計路線：作者首先將α-羧酸基團結合口袋的疏水性增強，然後又對結合口袋外層殘基（Ala192、Ala231和Val232）進行突變設計，結果發現這些改造酶催化能力均不夠理想。作者將催化能力較弱的F4改造酶進行5ps的分子模擬，經過優化後的構象作為Rosetta第二輪設計的模板。同時為了避免與β-苯基丙氨酸的苯環有空間衝突，321位和324位的殘基需要突變為體積更小的氨基酸。

基於以上改造原則與方法和Rosetta能量函數打分，作者從中挑選合適的改造酶，並對每一類底物類型都表達了一系列的改造酶。這些改造酶催化底物β-氨基酸的脫氨基能力如圖3。每一類底物類型都有高反應活性的改造酶。

圖3. 改造酶的β-氨基酸脫氨基活性。底物分別是(a) β-氨基丁酸，(b) β-氨基戊酸，(c) β-天冬醯胺，(d) β-苯基丙氨酸

每一類改造酶催化活性最好的蛋白信息和結合模式如表1和圖4。這些產生高活性的突變能夠適應底物的理化性質，同時在空間上與改造酶的構象互補。

圖4. a)野生型AspB和改造酶的底物化合物結構，b)野生型AspB結合口袋與天冬氨酸的結合模式（PDB 3R6V），c)改造酶B19與β-氨基丁酸的結合模式，d) 改造酶P1與β-氨基戊酸的結合模式，e) 改造酶N5與β-天冬醯胺的結合模式，f) 改造酶F29與β-苯基丙氨酸的結合模式，改造酶的結合模式均由Rosetta軟體預測

將改造酶的編碼基因轉導至大腸桿菌，然後使用高密度發酵方法提高蛋白的表達量。將大腸桿菌裂解液與含有α,β-不飽和羧酸的溶液混合，用氨調節pH值。反應的轉化率、對映體過量百分數和最終分離產率如圖5。

圖5. a)改造酶B19的轉化率隨時間變化曲線，b) 改造酶P1的轉化率隨時間變化曲線，c) 改造酶N5的轉化率隨時間變化曲線，d) 改造酶F29的轉化率隨時間變化曲線

作者構建的工程菌株具有高效率、高原子經濟性等優勢，相關指標達到了工業化生產的標準。目前這項科研成果已實現落地轉化，通過與安徽華恒生物股份有限公司的合作，在近期完成了千噸級的生產線建設，相關產品潛在市場超過30億，有望在紫杉醇、度魯特韋與馬拉維若等抗癌與艾滋病治療藥物的生產過程中大幅降低生產成本。

參考文獻：

Computational redesign of enzymes for regio- and enantioselective hydroaminationRuifeng Li, Hein J. Wijma, Lu Song, Yinglu Cui, Marleen Otzen, Yu"e Tian, Jiawei Du, Tao Li, Dingding Niu, Yanchun Chen, Jing Feng, Jian Han, Hao Chen, Yong Tao, Dick B. Janssen & Bian Wu,Nat. Chem. Biol., 2018, 14, 664-670.

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