人蔘單體Rh2 誘導人肺腺癌A549/DDP細胞凋亡的體外研究

人蔘單體Rh2 誘導人肺腺癌A549/ DDP細胞凋亡的體外研究

周東波 胡成平 蘇曉麗 楊紅忠

作者單位:長沙,中南大學湘雅醫院呼吸內科

出處：中國肺癌雜誌2005 年8 月第8 卷第4 期

Chin J Lung Cancer , August 2005 , Vol . 8 , No. 4

【摘要】背景與目的 肺癌已成為人類癌症主要死亡原因之一。從植物中開發抗腫瘤藥物是國內外抗腫瘤新葯開發的一個熱點。本研究的目的是觀察人蔘單體Rh2 誘導人肺腺癌A549/ DDP 細胞系凋亡的作用,並探討其可能的分子機制。方法 體外培養的人肺腺癌A549/ DDP 細胞經不同濃度梯度的人蔘單體Rh2干預,分別應用MTT 實驗觀察其對細胞增殖的影響,用流式細胞術檢測細胞周期、凋亡指數及相關基因表達的改變,以及用雙抗體夾心EL ISA 法測定細胞上清液sApo21/ Fas 濃度變化。結果 人蔘單體Rh2 可抑制A549/ DDP 細胞的生長,並呈劑量、時間依賴作用。人蔘單體Rh2 處理A549/ DDP 細胞24 h ,實驗組凋亡指數顯著高於對照組( P 0. 05) 。實驗組p53 、Fas 陽性表達率顯著高於對照組( P

【關鍵詞】人蔘單體Rh2 肺腫瘤 A549/ DDP 細胞株 凋亡

【中圖分類號】 R285. 5 ;R734. 2

Study on apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line A549/ DDP induced by ginsenoside Rh2 in vit ro

Z HOU Dongbo , HU Cheng ping , SU X iaol i , YA N G Hongz hong .

Department of Res pi ratory Medicine ,Xiangy a Hos pi tal , Cent ral S outhern Uni versi t y , Changsha , Hunan 410008 , P. R. China

Corres ponding author : HU Cheng ping , E2mai l : hucheng p28 @hotmai l . com

【Abstract】Background and objective Lung cancer is one of the leading causes of cancer2related death inmankind. To exploit antitumor drug f rom plant has been a highlight at home and abroad. The aim of this studyis to investigate the apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line A549/ DDP induced by ginsenoside Rh2( G2Rh2 ) and to explore it s possible molecular mechanism. Methods The growth inhibition effect of G2Rh2 onA549/ DDP cells was evaluated by MTT assay. Cell cycle analysis , apoptosis index and tumor related gene ex2pression were detected by flow cytomet ry. The changes of sApo21/ Fas level in the cell culture supernatantwere determined by EL ISA method. Results G2Rh2 significantly inhibited the growth of A549/ DDP cellsin a dose2time2de2pendent manner. Af ter 24 hours』t reatment with G2Rh2 , apoptosis index of t rial groupwas significantly higher than that of cont rol group ( P 0. 05) . The positive expression rate of p53 and Fasin t rial group was significantly higher than that in cont rol group ( P

【Key words】Ginsenoside Rh2 ( G2Rh2 ) Lung neoplasms A549/ DDP cell Apoptosis

肺癌是我國乃至世界發病率最高的惡性腫瘤。隨著以鉑類為一線藥物的方案在晚期非小細胞肺癌化療中的廣泛應用,肺癌對鉑類的耐葯已成為目前關注的熱點。大多數化療藥物,無論單獨還是聯合,對晚期非小細胞肺癌療效均不佳,且毒副反應大,因此尋求新的化療藥物和逆轉耐葯藥物已成為目前研究的熱點。從植物中開發抗腫瘤藥物,是國內外抗腫瘤新葯開發的一個熱點。現代醫學研究發現人蔘單體皂甙Rh2(ginsenoside Rh2 , G-Rh2 ) 具有較強的抗腫瘤生物活性,研究表明它對卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、神經膠質瘤等腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用[ 1～4 ] 。但關於G-Rh2 對肺癌細胞的作用以及用於治療肺癌的研究國內外尚未見報道。本實驗以人肺腺癌A549/DDP 細胞株為受試對象,研究G-Rh2 的凋亡誘導作用,旨在進一步闡明中藥人蔘抗腫瘤作用的機制,為其應用於腫瘤的臨床治療提供更多的實驗依據,報道如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 A549/ DDP 細胞為採用恆定藥物濃度、周期性作用的體外誘導法反覆篩選建成的一株耐順鉑的細胞系,由中科院生物所生物大分子國家重點實驗室提供。G-Rh2 由吉林大學基礎醫學院生化研究室提供。四甲基偶氮唑藍(MTT) 為美國Sigma 公司產品。碘化丙啶(PI) 購自華美生物製劑公司。流式細胞儀型號為Coulter Epics AL TRa Hpper sort System ( 美國) 。CO2 細胞培養箱為美國SHELLLAB 公司產品。人Fas EL ISA 試劑盒購於晶美生物(北京) 有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 細胞培養傳代 將A549/ DDP 細胞置於含5 % CO2 、37 ℃的飽和濕度培養箱中,在RPMI1640 培養液(含有12 %胎牛血清、青黴素100 U/ ml 、鏈黴素

100 mg/ L) 中培養,0. 25 %胰蛋白酶消化傳代,取對數生長期的細胞進行實驗。

1. 2. 2 MTT 實驗 分別接種A549/ DDP 細胞懸液於96 孔板,每孔2 ×104 個細胞,24 h 後A549/ DDP 細胞中加入G-Rh2 , 藥物濃度分別為0. 1 ～1 000μmol/ L ;並設對照組,對照組中加入等體積的RPMI1640 標準培養液。每種濃度設3個復孔,將96孔培養板在培養箱中培養24 、48 、72 h ,觀察細胞形態變化。然後各孔分別加入MTT 溶液(5 g/ L) ,每孔10μl ,繼續在培養箱中培養4 h 後棄去上清,每孔加入DMSO (二甲基亞碸) 溶液100μl , 震蕩後室溫靜置10 min ,使其充分溶解,然後用酶標儀於570 nm 處測定吸光度(A) 值,計算細胞生長抑制率。抑制率≥50 %為對該藥物敏感。

1. 2. 3 流式細胞儀檢測細胞周期變化、凋亡指數及相關基因蛋白表達 用G2Rh2 50μmol/ L 處理對數生長期A549/ DDP 細胞24 h ;並設對照組,對照組中加入等體積的RPMI1640 標準培養液。經0. 25 %胰蛋白酶消化後, 收集1 ×106 個細胞, PBS 緩衝液洗滌,5 min ×3 次。70 %冷乙醇4 ℃固定,於碘化丙啶一步

染色液中染色後做流式細胞儀分析。激發波長為488 nm ,發射波長為530 nm。實驗重複2 次。通過相關軟體擬合出細胞周期各時相比例及凋亡指數。並用PBS 洗細胞5 min ×3 次,分別加入兔或鼠抗人p53 、Fas 以及Bcl22 抗體, 37 ℃孵育30 min , PBS 洗細胞5 min ×3 次,加入羊抗兔或鼠FITC2IgG 100μl ,37 ℃孵育30 min ,PBS 洗細胞5 min ×3 次,離心過濾,用流式細胞儀檢測細胞p53 、Fas 以及Bcl22 蛋白的表達。以熒游標記細胞為陽性細胞,計算陽性率。

1. 2. 4 細胞培養上清液sApo21/ Fas 檢測

用G2Rh250μmol/ L 分別處理對數生長期A549/ DDP 細胞24 、48 、72h ; 並設對照組, 對照組中加入等體積的RPMI1640標準培養液。取細胞培養上清液,雙抗體夾心EL ISA 法測定其sApo21/ Fas 水平,嚴格按照試劑盒說明步驟進行。主要步驟:酶標板每孔(抗人Fas單抗已包被於酶標板上) 加100μl 標準品(濃度分別為0 、31. 25 、62. 5 、125 、250 、500 、1 000 、2 000 ng/ L) 或樣品,室溫孵育120 min ,洗板4 次,再加入生物素化的抗人sApo21/ Fas 抗體和辣根氧化物酶標記的親和素,室溫孵育120 min ,洗板4 次,加入顯色劑100μl/ 孔,避光室溫20 min , 加入終止液100 μl/ 孔後變黃, 在450 nm處測OD 值, Fas 濃度與OD450 值之間呈正比,通過繪製標準曲線求出標本中Fas 濃度。

1. 2. 5 統計學處理 統計學方法採用χ2 檢驗、配對t檢驗及one2way ANOVA 方差分析,用SPSS10. 0 統計軟體包處理。

2 結果

2. 1 G-Rh2 對A549/ DDP 細胞的細胞毒作用 不同濃度的G-Rh2 干預A549/ DDP 細胞24 、48 、72 h 後,倒置顯微鏡下觀察。鏡下可見對照組細胞呈梭形或多邊形生長,細胞透亮,折光性好,狀態佳。A549/ DDP細胞系在0. 1μmol/ L 劑量組細胞形態無明顯改變;而在中劑量組(1～50μmol/ L) 細胞數目減少,細胞形態欠規則,呈梭形或少許圓形貼壁生長,胞漿內變化不明顯或略有變化,細胞形態變化隨著藥物濃度增加、作用時間延長而更加明顯;高劑量組(100μmol/ L 及以上)細胞折光性差,明顯增大,輪廓模糊,胞內空泡增多,部分細胞已壞死,漂浮於培養液中。MTT 檢測結果顯示其抑制作用隨藥物濃度增加、作用時間延長而增強,呈現劑量、時間依賴作用,經統計學檢驗差異有顯著性( P

表1 不同濃度G-Rh2 對A549/ DDP 細胞的生長抑制率( n = 3 , % , . x ±s)

Tab 1 The growth inhibition rate of A549/ DDP cells inducedby G-Rh2 of different concent ration ( n = 3 , % , . x ±s)Concent ration ofG-Rh2 (μmol/ L)

Time24 h 48 h 72 h0(Control group) 0 0 0

0. 1 12. 38 ±3. 68 3 15. 45 ±2. 33 3 18. 78 ±4. 34 3

1 16. 45 ±3. 21 3 23. 67 ±6. 32 3 30. 46 ±5. 11 3

10 26. 35 ±5. 24 3 30. 44 ±4. 87 3 35. 56 ±1. 78 3

20 34. 57 ±4. 36 3 40. 93 ±5. 39 3 45. 45 ±2. 66 3

50 39. 68 ±6. 23 3 50. 36 ±3. 64 3 54. 86 ±1. 89 3

100 49. 44 ±5. 48 3 57. 48 ±4. 35 3 64. 39 ±6. 22 3

1000 60. 36 ±7. 82 3 70. 37 ±5. 30 3 78. 44 ±3. 56 3

3 : P

2. 2 G-Rh2 對A549/ DDP 細胞系凋亡水平和細胞周期的影響 實驗組A549/ DDP 細胞凋亡指數38. 51 %顯著高於對照組5. 76 %( P 0. 05) 。

2. 3 G-Rh2 對A549/ DDP 細胞系凋亡相關基因陽性表達率的影響 實驗組A549/ DDP 細胞p53 陽性表達率35. 5 %顯著高於對照組27. 8 %( P

2. 4 G-Rh2 對A549/ DDP 細胞系細胞培養上清液sApo21/ Fas 含量的影響 實驗組A549/ DDP 細胞培養上清液於不同時間的sApo21/ Fas 含量均顯著低於對照組( P

3 討論

研究發現,雖然大多數化療藥物都具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用,但化療藥物的毒副作用限制了其臨床應用,而植物抗癌成份倍受人們關注。人蔘( Panaxginseng C. A. Meyer) 為五加科多年生草本植物,現代醫學表明人蔘具有抗腫瘤、抗衰老、抗輻射等多種生物學活性[5 ] 。G2Rh2 屬於二醇組皂甙,是由人蔘中提取的天然活性成分,近年來體內外實驗證實,它可以通過誘導分化或凋亡抑制腫瘤細胞的增殖與生長,如卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、神經膠質瘤等,並證明其對正常組織毒性甚低,但G2Rh2 能否誘導人肺腺癌A549/DDP 細胞的凋亡,國內外尚未見報道。

表2 G-Rh2 對A549/ DDP 細胞系細胞培養上清液sApo21/ Fas 含量的影響(ng/ L)

Tab 2 The effect of G2Rh2 on the level of sApo21/ Fas

in A549/ DDP cell culture supernatant (ng/ L)Group

Time24 h 48 h 72 h

Cont rol group 15. 65 ±2. 13 16. 37 ±3. 45 18. 34 ±1. 25

Trial group 8. 64 ±1. 52 10. 66 ±3. 24 12. 74 ±2. 88

P value

本研究結果提示,G-Rh2 可誘導細胞形態學發生改變,誘導細胞凋亡,影響細胞的增殖活力,抑制其生長,且這一變化在實驗範圍內呈現劑量、時間依賴性作用。於廣久等[6 ]觀察了G-Rh2 對人喉癌細胞株Hep22 的抗增殖作用。

李殿友等[4 ] 在檢測Rh2 對C6 膠質瘤細胞增殖率的實驗中,不同濃度(2 、4 、8μmol/ L) 的Rh2 對C6 細胞的增殖抑制作用隨劑量增加和時間延長而明顯增強,台盼藍排斥實驗證實C6 細胞存活百分率不論實驗組還是對照組均大於90 %,實驗結果說明Rh2 可明顯抑制體外C6 膠質瘤細胞的增殖,且在實驗劑量範圍內沒有明顯毒性。我們的實驗結果與其報道相一致。近年來研究發現許多抗腫瘤藥物作用於腫瘤細胞的G0 / G1 期。Lee 等[7 ] 用流式細胞儀檢測G-Rh2 體外抑制肝癌細胞SK-HEP-1 增殖的實驗表明, G-Rh2能夠使細胞阻滯於G1 期,滯留於G1 / S 關卡處,阻止其向S 期發展。Ota 等[8 ] 也報道G-Rh2 能夠使黑色素瘤細胞B16 發生G1 期阻滯,細胞周期的進行受阻。本實驗用流式細胞儀檢測也顯示, G-Rh2 以細胞毒性作用不明顯的劑量作用於A549/ DDP 細胞24 h 以後,實驗組的凋亡指數明顯高於對照組, G0 / G1 期細胞較對照組明顯增多,而S 期細胞數目減少,提示G-Rh2對A549/ DDP 細胞的周期調控作用主要發生於G1期,阻止其向S 期發展,可將細胞阻滯於G0 / G1 期,從而抑制其DNA 合成。

目前研究表明,誘導細胞凋亡的因素很多,不同的因素誘導細胞凋亡的信號傳導途徑不同[9 ] ,p53 、Fas、Bcl22 基因是較早確定的凋亡調節基因。肺癌的發生、發展與多種凋亡基因相關,如p53 缺失或表達異常,Fas、Bcl22 基因表達異常[ 10 ] 。為了探討G-Rh2 的作用機制,我們檢測了凋亡相關基因的陽性表達率。本研究實驗組A549/ DDP 細胞p53 、Fas 基因陽性表達率較對照組升高,Bcl22 基因陽性表達率較對照組下降。因此我們推測G-Rh2 可能通過上調p53 和Fas 基因及下調Bcl22 基因而誘導A549/ DDP 細胞凋亡。]

Apo21/ Fas 是一種細胞表面誘導凋亡的分子,也稱為CD95 ,相對分子量為44 600 ,系跨膜糖蛋白,屬於腫瘤壞死因子受體( TNFR) 與神經生長因子受體(N GFR) 超家族成員,是一個細胞凋亡信號受體,可以誘導Apo21/ Fas 蛋白所在的細胞凋亡[11 ] 。正常肺泡細胞上皮及肺癌細胞中均有Fas 表達[12 ] ;Apo21/ Fas配體(Apo21/ Fas ligand , Apo21/ FasL) 是一種Ⅱ型跨膜蛋白,與TNFR 家族有同源性,Apo21/ FasL 主要表達於活化的T 細胞、N K 細胞表面。Apo21/ Fas 與Apo21/ FasL 結合是Apo21/ Fas 在體內發揮作用的唯一途徑。Apo21/ Fas 受體有兩種形式: 膜型Apo21/Fas ( mApo21/ Fas ) 和可溶型Apo21/ Fas ( sApo21/Fas) 。細胞表面的mApo21/ Fas 通過與Apo21/ FasL結合而激發Apo21/ Fas 陽性細胞凋亡,sApo21/ Fas 通過與Apo21/ FasL 競爭結合而抑制mApo21/ Fas 途徑介導的細胞凋亡,因此可以認為sApo21/ Fas 與腫瘤細胞逃避免疫監視以及惡性腫瘤的演變有關[13 ] 。梁啟廉等[ 14 ] 研究發現58 例肝癌患者化療後有效患者血清sApo21/ Fas 濃度明顯低於化療前。本實驗應用G2Rh2 不同時間干預A549/ DDP 細胞後,細胞培養上清液sApo21/ Fas 含量均顯著低於對照組,說明G2Rh2可通過Fas/ FasL 系統途徑誘導肺腺癌細胞凋亡。

綜上所述, 人蔘單體Rh2 具有誘導人肺腺癌A549/ DDP 細胞凋亡的作用,其分子機制可能是上調p53 和Fas 及下調Bcl22 的表達、通過Fas/ FasL 系統途徑誘導細胞凋亡。

參 考 文 獻

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(收稿:2004207226 修回:2004209229)

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