李毓龍組開發新型多巴胺熒光探針——仇子龍點評

責編丨劉志睿

點評丨仇子龍

多巴胺（DA）是神經系統中關鍵的單胺類神經遞質。在多種脊椎動物中樞神經系統中，DA廣泛調節了許多複雜的生理功能，包括學習【1】、獎賞【2，3】、注意力【4】和運動控制【5】等。 在人類大腦中，DA傳遞受損與多種神經系統疾病有關，包括多動症【6】、精神分裂症【7】、帕金森氏病【8】等。此外，可卡因等精神興奮劑通過改變大腦中的細胞外DA水平來發揮成癮作用【9-12】。

儘管DA具有這些重要作用，但是仍缺乏在複雜行為期間對DA釋放的精確測量，這在很大程度上歸因於現有DA檢測方法的局限性。腦內微透析長期以來一直是細胞外DA濃度定量測量的金標準。然而，其相對較慢的採樣率（兩次採樣之間間隔 > 1分鐘，通常約為10分鐘），制約了在複雜和快速演變的行為中檢測DA動態變化。快速掃描循環伏安法（FSCV，Fast-scan cyclic voltammetry）是一種電化學方法，可以測量細胞外DA濃度的變化，具有10毫秒的時間解析度和約1 nM的靈敏度。然而，FSCV需要基板氧化來進行信號檢測；因此，這種方法不能有效區分DA與其他結構相似的神經遞質，例如去甲腎上腺素（NE）。此外，微透析和FSCV法都需要將相對較大的探針（直徑約70-300 mm）植入腦組織，這限制了實現精確測量內源性DA釋放的能力。

有別於直接測量，目前已經發展出使用間接方法（例如測量DA受體的下游靶標的激活）來近似測量DA的動態變化。基於細胞的DA報告基因，例如CNiFERs使用內源性表達DA受體的HEK293細胞和細胞內Ca2 +指示劑將細胞外DA信號強度與細胞的熒光變化偶聯。儘管這種具有高靈敏度，但需要藉助細胞移植的技術，並且僅能報告囊泡內DA的傳遞。 TANGO技術以及它的下一代改良技術通過偶聯β-arrestin信號通路測量內源性DA釋放。儘管該方法能夠使細胞類型特異地測量DA報告基因並且適合於體內測量，但是長信號放大時間（大約數小時）無法動態快速地對DA信號傳導進行實施測量。

為更好地研究多巴胺在生理和病理過程中起到的作用，研究人員需要實時檢測活體內特定腦區的多巴胺信號變化，然而現有的檢測手段並不能滿足研究人員的需求。7月12日，Cell在線報道了北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯合中心、PKU-IDG/麥戈文腦科學研究所李毓龍研究組題為A genetically-encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice的研究論文。該研究中開發了一系列同時具有直接、快速、高敏感度和細胞類型特異性檢測的新型DA熒光探針感測器，並將其應用在果蠅、斑馬魚和小鼠中檢測內源多巴胺動態變化，該探針將成為研究多巴胺相關神經環路的重要工具。

這些感測器，被稱之為GRABDA（GPCR-activation-based-DA，基於G蛋白偶聯受體- 活化的DA感測器)。研究組通過將對結構變化敏感的熒光蛋白（cpEGFP）嵌入人源多巴胺受體，使多巴胺這一化學信號轉化為熒光信號，結合現有的成像技術，即可實時監測多巴胺濃度的動態變化情況。通過反覆的基因工程和優化實驗，得到了兩個GRABDA感測器適用於多巴胺釋放量不同的腦區：一個是對DA具有中等半數效應濃度（約130 nM）的GRABDA1m（縮寫為DA1m），和一個對DA具有高半數效應濃度（約10 nM）的GRABDA1h（縮寫為DA1h）。這兩種感測器能夠實時檢測小鼠急性腦切片中的內源性DA含量，以及多種動物模型的完整大腦的DA，包括蒼蠅、魚和小鼠，適用於多巴胺釋放量不同的腦區。

由於開發出的探針具有可基因編碼的特性，李毓龍研究組通過轉染、病毒注射以及構建轉基因動物等手段，將探針表達在細胞、小鼠腦片或者活體果蠅、斑馬魚、小鼠中。實驗結果表明，長時間表達該探針對模式生物的生長狀態無明顯影響。利用該探針，他們檢測到了電刺激小鼠腦片引發的多巴胺釋放，並在活體果蠅、斑馬魚和小鼠的大腦中檢測到了與嗅覺刺激、視覺刺激、學習記憶、交配行為相關的多巴胺信號變化。該探針將成為研究多巴胺相關神經環路的重要工具。

特別值得一提的是，3天前李毓龍研究組在Nature Biotechnology在線發表的乙醯膽鹼探針與本文中的多巴胺探針有著相似的工作原理（NBT | 北大李毓龍組開發新型乙醯膽鹼熒光探針——專家點評）。兩者都是基於人源神經遞質受體，將神經遞質結合受體所引發的受體構象變化轉化為熒光信號的變化，這說明此發展策略具有可推廣性。這兩項工作為今後大規模開發其他神經遞質、神經調質探針奠定了紮實的研究基礎。除此之外，前不久李毓龍組還在Current opinion in neurobiology雜誌上發表綜述文章專門討論了用於檢測神經遞質的可遺傳編碼的熒光探針，並提到了基於G蛋白偶聯受體的感測器的潛在應用。

北京大學生命科學學院李毓龍研究員為本文的通訊作者。李毓龍研究組博士生孫芳妙、曾健智、井淼為共同第一作者；馮傑思、駱奕辰、雍自昊、王歡為此項研究成果做出了重要貢獻。

專家點評

仇子龍（中科院神經科學研究所研究員，國家「傑青」 ）

第一次見到李毓龍，是在2009年4月的美國冷泉港學術會議，很難讓人不注意到這麼一個在每次報告後都會提問的年輕人。那時候我知道他是著名科學家錢永佑（Richard Tsien）的博士後，他對腦科學的很多領域都非常感興趣，對每個報告都要思考一番，然後提問。

後來很高興得知毓龍全家喜歸母校北大，也知道他開闢了全新領域的研究，選擇了一個與博後導師錢永佑教授完全不一樣的方向，建立遺傳編碼探針的方法去探究神經化學遞質的體內定量化測量與標記。有趣的是，這個方向讓我想起了他導師的弟弟，著名科學家，諾貝爾化學獎獲得者錢永健（Roger Tsien）。當我在UCSD做博士後的時候，經常看見錢永健教授在每次學術會議上，認真聆聽，積極提問的身影。錢永健教授是學化學出身的，但是對神經科學的方方面面都非常感興趣，也建立了一系列對整個生物學界都非常重要的綠色熒光蛋白探針與感受電壓變化的化學探針等等，也因此獲得了諾貝爾化學獎。遺憾的是，錢永健教授幾年前離我們而去了。

讓我們高興的是李毓龍教授，彷彿舉起了錢永健教授的火炬，肩負著錢永健與錢永佑兩位著名科學家的信念，帶給我們了一個又一個重要的分子探針。李毓龍教授在這個星期發表的兩篇重要文章，分別建立了遺傳編碼的乙醯膽鹼與多巴胺遞質的分子探針，這兩個重要工作堪稱是劃時代的貢獻，將重塑神經科學的研究圖景。

在李毓龍教授的工作之前，我們只能研究某種神經元的電活動活性，卻無法知道我們的大腦釋放的各種化學遞質在體內究竟有多少？在各種生理活動的時候，神經化學遞質的釋放究竟如何實時做出反應？李毓龍教授的工作便讓我們能夠從此將化學遞質的研究走進腦內在體研究與定量化研究的範疇。非常值得一提的是，李毓龍教授的這兩篇文章都與許多同行開展了廣泛的合作，分別在多種模式生物中驗證了新型分子探針的靈敏性與可靠性，這些同行的慷慨合作讓毓龍教授可以將分子探針這把利劍越磨越鋒利。讓我們期待李毓龍教授繼續為我們帶來更多的驚喜，在北大做出更精彩的工作！

參考文獻

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