自身抗體的自動化檢測趨勢

最新 07-14

一、自身免疫檢測背景

自身免疫性疾病（AID）泛指機體免疫效應細胞或免疫效應分子針對自身組織或細胞產生病理性免疫應答反應，由自身免疫反應參與發病機制，導致組織損傷或功能障礙的疾病。近年來，由於人類對AID認識的提高，加之臨床經驗的積累和實驗室診斷技術的進步，AID發病率明顯上升，其總體發病率佔世界人口的3%-5%。而伴隨著對AID的進一步認識，我國AID的發病率及患病率也呈現快速遞增態勢。常見的分類按自身抗原分布範圍，分為器官特異性（或局限性）AID和系統性（或器官非特異性、全身性）AID。AID發病範圍幾乎可累及人體的各系統、組織和器官，且涉及臨床各專業學科。因此AID已成為嚴重影響人類健康的疾病。AID的診斷主要依靠臨床表現、實驗室檢查、組織病理學和影像學檢查。在實驗室檢查中，自身抗體檢測對AID診斷和鑒別診斷至關重要，自身抗體已成為AID的最重要特徵。

由於自身抗體檢測是AID診治中的重要工具，隨著早期診斷、規範化治療的開展，自身抗體檢測在疾病診斷、監測及預後評估中發揮的作用也受到更多重視。但是，由於目前自身抗體檢測缺乏統一的標準化檢驗方法，加上工作條件、傳統診療習慣、結果判讀以及醫療保險限制等方面的因素影響,導致自身抗體檢測在臨床應用上存在著不統一、不規範現象。近十年國內自身抗體質控結果及近期全國多中心實驗室調査的數據顯示，部分自身抗體檢測的開展率及正確率並不理想,自身抗體檢測的方法也很不統一。同時,在自身抗體結果解讀方面也存在著誤差或誤判。自身抗體檢測標準化、統一化及自動化是未來趨勢，如何標準化以及正確解讀是我們面臨的挑戰。

二、自身抗體檢測的自動化及標準化

目前國內開展自身抗體檢測尚無統一標準：自身抗體種類數量繁多，國外臨床常規檢測已達上百種，而國內常規開展只有幾十種甚至十幾種，手工操作比重大，自動化程度低，不同自身抗體沒有採用相應的國際標準中推薦的檢測技術，定性檢測多，定量檢測少，質量管理較差，準確性程度低，實驗室出結果慢，這都給臨床對於自身免疫疾病診斷帶來了困擾，因此涵蓋多種自身抗體檢測技術的自動化平台變得尤為重要。自動化的解決方案不僅能夠減少人為操作帶來的誤差，能夠提升實驗室檢測效率，更為重要的是能夠實現自身抗體嚴格意義的定量檢測及判讀標準化。

（1）酶聯免疫吸附測定（ELISA）是將抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用原理有機地結合起來，在絕大多數自身抗體定量檢測中得到廣泛應用。間接免疫熒光檢測（IFA）是用特異性的抗體與切片中的抗原結合後，繼用間接熒光抗體，與前面的抗原抗體複合物結合，形成抗原抗體熒光複合物。在熒光顯微鏡下，根據複合物的發光情況來確定所檢測的抗原。此種方法學多用於自身抗體的篩查性檢測，如抗核抗體ANA，抗中性粒細胞胞質抗體ANCA，綠蠅短膜蟲dsDNA，動物組織片等，IFA是此類篩查性抗體檢測的金標準。

兩種檢測方法是目前自身抗體檢測最常用的檢測手段，但是由於國內技術水平的限制，多數實驗室室仍舊採用人工處理操作，雖然操作者都受過專業化的基礎知識和動手能力的培訓。但在實際操作過程中，由於各種因素的存在都對檢測結果產生影響，如ELISA手工操作，必經過8個步驟，樣本手動保存、試劑準備、加樣、保溫、洗滌、顯色、比色、結果判定與報告，如果其中任一步驟操作不當都會影響檢測結果。

全自動酶免熒光免疫分析一體機能夠同時實現自身抗體酶免及熒光檢測兩種技術平台的自動化檢測，並能夠消除人為操作的誤差及主觀因素。

圖1 自身免疫全自動集成檢測系統中的全自動酶免熒光免疫分析一體機

（2）IFA檢測技術中的熒光核型判讀及滴度確定歷來是檢驗人員最為頭疼的話題，一個合格的熒光判讀人員需要有至少2-3年以上的閱片經驗，據文獻報導，即使是兩名具有多年經驗的閱片人員，其對相同熒光片判讀的結果還有20%-30%的差異，可見如何客觀及準確獲得熒光判讀的結果是提升自身抗體檢測標準化的關鍵。採用3D數學建模分析技術能夠利用當前的高科技手段針對不同的熒光核型形成獨特的3D建模公式，利用此公式可快速計算未知樣本核型的結果，是目前全球最先進應用於熒游標准化判讀的技術。

圖2 斑點型及均質型3D數學建模

圖3 核仁型及核點型3D數學建模

圖4 自身免疫全自動集成檢測系統中的全自動免疫熒光顯微鏡

（3）化學發光技術是廣泛應用於傳染病相關標記物，激素，腫瘤，甲功，藥物濃度檢測的一種重要的檢測技術。但是在自身免疫診斷中的應用有屬於剛剛起步，北美及歐洲地區率先應用化學發光技術檢測自身抗體，其所有檢測項目能夠隨機組合，規避樣本數量，項目種類所帶來的成本及操作等不利因素。最大限度保證實驗結果的準確性和操作的便捷性，能夠第一時間給臨床帶來全定量的檢測結果。從這幾年美國的CAP數據表明，在自身抗體檢測的專業實驗室，化學發光作為一種新型技術，正在逐漸取代傳統的酶聯免疫吸附測定技術。

化學發光採用特殊的液態磁珠包被技術，能夠極大提高抗原與樣本接觸的表面積，增加敏感性。特殊優化處理的抗原及磁性分離清洗最大程度減少非特異性信號的干擾，提高特異性。異魯米諾激發光帶來檢測線性的提升，許多在使用常規酶免檢測得到超過上限的結果在發光平台能夠輕易得到數值。鑒於其良好的批間批內CV，使用基於化學發光技術的免疫分析儀能夠解決目前臨床實驗室對自身免疫疾病相關血清學自身抗體定量檢測的困擾。

圖5 自身免疫全自動集成檢測系統中的全自動化學發光免疫分析儀

三、自身免疫檢測自動化的優勢及發展前景

1、實驗室檢測效率的提升

引進自身免疫全自動集成檢測系統能夠真正實現一套檢測系統覆蓋所有自身抗體的自動化檢測，併兼顧不同技術方法學的優點。高通量的優勢輕鬆應對日常臨床樣本檢測量日益增長。徹底改變原始的人工操作效率低、易出錯的弊端，大大提高結果的準確性。

圖6 100個熒光測試樣本使用自動化及手工的效率比較

2、滿足IFA與EIA檢測的操作判讀高標準化、規範化的要求

徹底告別人工處理IFA與EIA實驗操作的繁瑣過程，實現真正的全自動化。針對大樣本量、多樣本化實現一機同時操作，無需購置多台獨立檢測儀器。核型判讀及終點滴度自動輸出，客觀性強，無需熒光暗室。

圖7 All in one，多個平台有機融合在一起實現多方法學的組合及結果輸出

3、滿足臨床對自身抗體檢測及時定量，檢測線性的要求

不同項目可以隨機組合得到多種不同定量結果。這意味著臨床上在極短的時間內就能拿到病人的量化指標，有助於醫生在第一時間就能對病人的患病情況，嚴重程度作出準確判斷，方便醫生對病人病情的進一步治療，同時也為病人今後的治療提供了一個非常有價值的參考。全自動、全封閉檢測技術，避免了操作人員主觀判斷誤差，室間質控成為可能。