局灶性皮質發育不良的病理機制

人類大腦皮質的發育經過細胞增殖、分化、遷移、突觸發生和重組形成一個功能性皮層。皮層組合的破壞可以導致皮質發育畸形(Malformations of cortical development,MCDs)。MCDs可導致多種疾病，其病理類型取決於發病機制和發病時間。這些病理改變與難治性癲癇、認知損害和運動、感覺損害有關。

局灶性皮質發育不良(Focal cortical dysplasias,FCDs)是MCDs的亞組之一，以異常皮質分層和神經元遷移、生長和分化異常為特徵，可累及一個獨立腦區、幾個腦葉甚至整個半球。FCDs常導致難治性癲癇，也是癲癇手術中最常見的皮質畸形。FCDs與基因突變的關係，特殊分子通路的參與，其對皮質發育和癲癇潛在機制的啟示仍在深入研究中。近期的研究發現哺乳動物雷帕黴素靶蛋白信號通路(mammalian target of rapamycin,mTOR)活化與FCDs神經元細胞結構和電生理性質有關，可能說明癲癇產生和皮層紊亂機制。在此我們研究了FCDs的分子機制以探究診斷和治療方法的潛在靶點。

神經病理和臨床放射相關研究

FCDs代表性地展示了不同程度紊亂的皮質分層，組成細胞反過來通過皮質展示了形態學改變和/或異常組織。這些結果最初是在難治性癲癇患者術後切除的發育不良組織中發現。早期的報道發現擴大的圓形神經元(發育不良細胞)在受累皮層除第一層以外的各層分布，而氣球樣細胞是畸形細胞，位於皮層深處靠近白質，表現為過多的胞漿環繞多個胞核。此後，研究者基於新的組織學發現提出了幾個分類方法。然而，不同的命名方法導致對組成細胞定義不一致，對後期其電生理特性和蛋白表達的研究有一定影響。

為了建立全球共識，國際抗癲癇聯盟(ILAE)在2011年發布了一個三級分類系統，不僅基於組織學特徵，綜合考慮臨床和神經影像表現。該分類方法逐漸被FCDs分子基礎研究所接受(表 1)。目前假說認為FCDⅠ型和Ⅲ型是由於遷移後期發生的皮質缺陷或損傷。根據該分類標準，FCDⅠ型患者通常有嚴重的早產史、缺氧-缺血損傷、頭部外傷、顱內出血或產前、圍產期卒中史。患者通常表現為精神運動發育遲滯、局灶性功能損害和耐藥性癲癇。FCDⅠ型被認為是一種獨立的畸形，其異常皮層分層可呈放射型(Ⅰa)、切線型(Ⅰb)和混合型(Ⅰc)見圖 1。神經元密度通常增加，伴有皮層厚度減小和神經元微柱富集。核磁共振(MRI)表現為局灶性皮質發育不良，偶爾可見皮層下白質中等異常信號(圖 1)。另一方面，按照新的FCD分類，FCDⅢ型包括多種病理條件。FCDⅢ型與發育早期的原發病理類型有關，比如海馬硬化(Ⅲa)，引起癲癇的腫瘤例如神經節膠質細胞瘤(Ⅲb)，臨近血管畸形(Ⅲc)和包括頭部外傷、缺氧缺血損傷和腦炎導致的致癇灶(Ⅲd)。這些病變通常在MRI上表現為異常特徵，儘管不總是具有因果關係。

圖1 FCD Ⅰa、Ⅱb型神經影像和組織學特徵冠狀位MRI T2相示左顳葉內側皮質發育不良(箭頭所示)，與FCD Ⅰa型相符(上層)。切除標本NeuN染色(神經元標誌)示缺少正常分層而表現為特徵性的神經元放射性分布(×10)。冠狀面FLAIR相提示FCDⅡb型右頂葉皮質增厚，皮質及皮質下高信號。皮質下高信號延伸至右側腦室邊緣(倒三角徵象)。切除標本蘇木精伊紅染色示典型的氣球樣細胞(×20)

表1 FCD分型：2011年國際抗癲癇聯盟(ILAE)根據 FCD病理的認知發布

另一方面，FCDⅡ型是由異常細胞發育和成熟導致，其特徵表現為形態異常神經元和典型的皮質分層紊亂和氣球樣細胞。FCDⅡ型進一步分為無氣球樣細胞的Ⅱa型和氣球樣細胞的Ⅱb型(圖 1)。因此氣球樣細胞成為FCDⅡb型的決定性細胞種類，也可存在於皮質結節(又稱為巨細胞)和半側巨腦畸形(Hemiegalencephaly,HME)。臨床特徵表現為較小年齡時即出現耐藥性癲癇，高度認知功能下降，但手術預後比FCDⅠ型好。最常見的MRI表現為皮層增厚、異常溝回和皮層下白質高信號延續至側腦室邊緣，形成所謂的穿通征(圖 1)。穿通征有灰白質分界不清、皮層增厚和腦溝底部發育不良，最常見於FCDⅡb型。術後癲癇控制效果較好。然而這種良好的預後是由於本身致癲作用低還是解剖學上更易識別仍不清楚。

FCDⅡ型不同於FCDⅠ型的另一個特徵是，深層皮層細胞表達未成熟標誌物，且在皮質表層極少表達祖蛋白質。氣球樣細胞表達的標誌物是神經元特異性核蛋白(Neuronal nuclei,NeuN)、微管相關蛋白1B(Microtubule-associated protein 1B,MAP1B)、波形蛋白、巢蛋白、α-微管連接蛋白和膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic portein，GFAP)，表明這些細胞不成熟性和/或混合細胞系來源。此外，氣球樣細胞也表達幹細胞標誌物，例如Sox2，Oct4，c-Myc和Klf4，這個特徵與增強mTOR信號通路有關。總而言之，FCDⅡ型中細胞分化損害是皮質畸形的組織學特徵。

發病機制

儘管組織病理分類是定義FCDs分型的基礎為出發點，但根據細胞和分子機制新發現更新目前的分類也很重要。因此，我們回顧了FCDs的分子生物學和電生理研究，強調其可能的治療靶點。

哺乳動物雷帕黴素靶蛋白及相關通路

mTOR信號通路與很多皮質畸形的病理機制有關。mTOR是一種進化保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，是發育和成熟階段的重要調節者，調控細胞生長、增殖、能量代謝、炎症和抑制自噬。mTOR也是整合多種細胞內外信號的關鍵調控點，包括營養素、生長因子、細胞因子、激素、細胞應激源和氧感測器(圖 2)。mTOR由兩個蛋白複合物組成，mTORC1和mTORC2。mTORC1對雷帕黴素敏感且通過磷脂醯肌醇3-激酶 (Phosphoinositide3-kinase，PI3K)-蛋白激酶 (Protein kinase B，AKT)信號通路整合多種信號。mTORC1通過激活下游信號通路，例如核糖體蛋白S6(Ribosomal protein S6)-核糖體蛋白，S6激酶-1(Ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6 K1)信號通路和蛋白翻譯起始因子4E結合蛋白(Initiation factor 4E binding protein-1，4E-BP1)-蛋白翻譯起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E) 通路。另一方面，mTORC2對雷帕黴素相對不敏感，調控細胞骨架等不同激酶。mTORC1和mTORC2由上游調控基因抑制，包括抑癌基因結節性硬化複合物1(Tuberous sclerosis complex1，TSC1)和結節性硬化複合物2(Tuberous sclerosis complex2，TSC2)，同源性磷酸酶-張力蛋白基因(Phosphatase and tensin homolog，PTEN)，神經纖維素1基因(Neurofibromin1，NF1)和STRADA基因(STE20-related kinase adaptor alpha,STRADA)，見圖 2、3。

圖2 mTOR信號通路哺乳動物雷帕黴素靶蛋白複合物(mammalian target of rapamycin,mTOR)，特別是mTORC1，整合包括生長因子、激素和能量狀態的多條信號通路。第一層整合發生在TSC1/TSC2複合物，包括RAS-MAKP、PI3K-AKT-mTOR和AMPK等信號通路。根據活化程度不同，TSC1/TSC2通過大腦內豐富的Ras同系物負性調節mTOR。mTOR依次調節下游底物(S6KI/S6，4E-BPI/eIF4E)，其下游底物進而控制蛋白合成、細胞生長和能量代謝。信號通路中其他重要調控蛋白(PTEN、NF-1和STRADA)的作用位點如圖所示

圖3 mTOR信號通路在皮質發育不良和癲癇發生中的作用mTOR信號通路編碼上游調控蛋白(TSC1，TSC2，STRADA,PTEN或者NF-1)的基因突變可使通路過度激活(粗線所示)，信號通路的組成部分RAF、AKT、PI3K和mTOR(紅色所示)在TSC1/2整合。近期研究發現HPV16E6以及其他DNA病毒在FCD Ⅱa和FCD Ⅱb中的作用提示感染可能是FCD病理的病因。同時，mTOR信號通路激活導致異常細胞生長和增殖，導致皮質發育不良的解剖病變。此外，mTOR信號通路活化能修飾神經遞質受體和離子通道表達，改變細胞膜特性和突觸結構，因此導致神經元過度興奮。這些細胞和電流水平形態和功能上的改變可能導致皮質發育不良患者癲癇，局灶缺陷和認知障礙

在發現TSC1和TSC2對mTOR的抑制作用之後，結節性硬化患者分子結構異常能夠激活mTOR信號通路。FCDⅡb型與神經結節在組織結構上的相似提示mTOR信號通路可能是FCDs的潛在病因。事實上，mTOR信號通路活化以下游S6K1和S6分子磷酸化增高為標誌，先在FCDⅡb型中發現，而後在HME和神經節膠質瘤中發現。mTOR信號通路尤其是在FCDⅡb型和神經結節明顯，其中＞80%的氣球樣細胞和巨細胞表現為S6K1和S6磷酸化增強。相反，FCDⅠ型未發現mTOR信號通路增高。一些FCDⅡb型病例也表現出上游磷酸醯肌醇3依賴性激酶(Phosphoinositide-3-dependent kinase 1，PDK1)和AKT，和下游底物血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和信號轉導和轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)。mTOR信號通路在FCDs的病理生理機制中的作用通過PTEN基因敲除小鼠模型進一步證實。這些動物與FCDs的組織學特徵類似，且很多可以被雷帕黴素抑制。

近年來，人乳頭病毒(Human papilloma virus，HPV)癌蛋白E6在一組FCDⅡb型患者中檢測到，證明FCDs可能與病毒感染有關。在切除組織中，E6與磷酸化S6蛋白主要共同表達在氣球樣細胞中，提示HPV16可能通過mTOR改變皮質發育(圖 3)。這一發現通過HPV16轉染胚胎期的小鼠進一步證實，被轉染的小鼠表現出局灶性皮質發育畸形伴有磷酸化S6表達增高。

目前，兩個機制與HPV16 E6癌蛋白和mTORC1活化相關： HPV16 E6癌蛋白與TSC2結合併促進其泛素介導的降解； 活化PDK1和AKT，隨後抑制TSC1/TSC2。PI3K-AKT-mTOR信號通路被證實通過調控蛋白翻譯，促進巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV-1)和其他雙鏈DNA病毒複製，可能感染其它細胞。最近的一個研究在18/20例FCDⅡb型患者和6/27例FCDⅡa型切除的病變組織中檢測到HPV16病毒。在一些組織的氣球樣細胞和發育異常神經元檢測也得到其他的病原體例如CMV，HSV-1和人類皰疹病毒6B(HHV-6B)。目前仍需要更多研究證實病毒感染在FCDs發病機制中的作用；並闡明傳播方式，感染時機和傳播機制；評估其在皮質發育不良中的流行病學作用。

基於mTOR信號通路的廣泛作用，一些發育性腦腫瘤與FCDs、癲癇和mTOR信號通路活化相關並不意外。神經節膠質瘤就符合這種情況，且其為最常見的合併難治性癲癇的兒童腦腫瘤。該腫瘤可直接或間接與FCDs相關，並且基於其致癇性歸類於FCDⅢb型。在組織學上，神經節膠質瘤由多種神經元發育異常細胞和腫瘤膠質細胞組成。非典型神經節細胞也被觀察到和氣球樣細胞有類似的組織學特徵和蛋白表達。

mTOR信號通路在神經節膠質瘤病理機制中的作用首先由神經元和非典型節細胞中磷酸化S6K1和S6表達增高證實。這一發現進一步由磷酸化的上游PDK1，AKT因子、mTOR及下游4E-BP1，eIF4G，S6K1和S6增高證實。如同黑色素瘤，節細胞膠質瘤mTOR信號通路活化的機制可能是RAF-MEK和PI3K-AKT-mTOR信號通路的雙重作用(圖 3)。 近期研究發現有20%～60%的神經節膠質瘤攜帶鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1基因V600E突變，尤其是在神經元和非典型節細胞。這一發現提供了治療的可能，因為在其他腫瘤中抑制著兩條信號通路能顯著降低細胞的生存率。

mTOR信號通路的其他調控因子或組成部分在其他皮質發育畸形的病理機制中發揮重要作用。例如，在HME和多小腦回畸形巨腦畸形腦積水綜合征(Megalence phaly polymicrogyria polydactyly hydrocephalus，MPPH)患者的腦組織中發現了PI3K，AKT3或mTOR體細胞突變。研究已在羊水過多伴巨腦、癥狀性癲癇綜合征(Polyhydramnios megalencephalyand symptomatic epilepsy syndrome，PMSE)發現STRADA突變。另一方面，RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR的功能紊亂在皮質發育不良中發揮作用。並且這兩條信號通路在不同程度上相互聯繫，例如，通過STAM結合蛋白(STAMBP-binding protein，STAMBP)和生長因子受體結合蛋白2(Growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)，見圖 2。STAMBP突變與腦小及血管畸形綜合征(Microcephaly capillary malformation syndrome，MIC-CAP)患者中RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR信號通路功能增強有關(圖 3)，表明了信號通路在細胞生長、增殖和血管生成中的作用。

局灶性皮質發育不良的致癇性

癇性發作是FCDs中最常見和具有挑戰性的臨床表現之一。在過去的十年，研究在發育不良皮質及其周圍神經元細胞的電生理特性以及異常分子信號通路與神經元過度興奮之間的聯繫取得了令人振奮的發展。在獲得性癲癇的多個動物模型中，例如顳葉癲癇和嬰兒痙攣症，均檢測到mTOR信號通路激活，且雷帕黴素可抑制其癲癇發作，表明mTOR信號通路在癲癇發生中的作用。

目前爭論的焦點在於癇性發作起源於FCDs，還是起源於其周圍腦組織抑或是兩者均有仍不清楚。這是一個值得注意的問題，相當一部分患者在切除病變組織後仍有難治性癲癇。通過對兒童患者新切除皮質發育不良腦切片進行電生理活動記錄，結果發現並不是所有神經元細胞表現為異常電生理特徵。在這些腦組織中，大椎細胞由於充足的Ca2+電流和去極化時流入表現為興奮性增高，而形態異常和未成熟椎體細胞未表現出異常電活動。氣球樣細胞自身並未表現出興奮性，但是這些電活動「沉默」細胞能夠促進周圍皮質的突觸重組，進而導致腦組織興奮網路。

其中一個潛在的機制是FCDs神經元興奮性增高是由於發育不良神經元的谷氨酸能受體表達增高所致，例如N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體亞基NR1-1a，1b，2a，2b，NR2A/B，NR2B和α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(a-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA)受體亞單位GluR1和GluR2/3。然而，有研究報道谷氨酸能受體表達程度不同，這可能是由於組織學命名或實驗條件不同。對FCDs的超微結構研究發現，其突觸密度和興奮/抑制神經元比例與鄰近皮質有明顯差異，這可能導致發育不良皮質及皮質周圍神經元環路的改變引起癲癇發生。根據對FCDs患者顱內腦電圖記錄結果發現，致癇灶可以延伸到影像學識別的損傷之外，並且其對鄰近或遠處區域傳播方式複雜。FCDs的電活動模式比其他病理改變更有特徵性，尤其是發作期。例如，FCDs顱內監測的典型活動為發作期和發作間期陣發、低電壓、快速電活動，陣發快波或多棘波，反過來也表徵了發作區域。其他代表發作起源的形式包括棘慢波活動，爆發性多棘波和delta刷。

另一個可能的機制是FCD所致的難治性癲癇的機製為多耐葯蛋白(Multidrug resistance gene-1 /p-glycoprotein，MDR1)和多耐葯相關蛋白1(Multidrug resistance-associated protein-1，MRP1)在發育不良皮質中神經元、星形細胞、發育不良神經元和氣球樣細胞表達增高。多葯耐葯蛋白(Multidrug-resistant proteins，MDRP)可將神經系統的抗癲癇藥物(AEDs)清除，因此降低了腦內有效藥物濃度。然而，目前仍不清楚致癇灶中這些轉運蛋白的表達增高是原發還是繼發於慢性癲癇還是AEDs使用。

局灶性皮質發育不良引起的癲癇：來源於結節性硬化症的經驗

結節性硬化症(Tuberous sclerosis complex，TSC)是由於mTOR調控基因TSC1或TSC2突變所致常染色體顯性疾病。這種突變是皮質結節形成的典型機制，在組織學上與一些FCDs相似並且總是與難治性癲癇相關聯。由於mTOR信號通路在其病理機制中的明確作用，TSC成為研究FCD癲癇發生的有價值的模型。在這種意義上，TSC2突變使谷氨酸介導的神經元興奮性增高，且TSC患者術後切除的發育不良腦組織顯示興奮性增高。這一發現在TSC敲除小鼠進一步證實，全細胞膜片鉗發現AMPA介導的興奮性突觸電流增高。另一方面，由於谷氨酸受體表達不同，異常神經元和膠質細胞比例在神經結節癲癇發生機制中發揮重要作用。因此，表達異常AMPA和NMDA受體的發育不良神經元比例高的神經結節相比主要為巨細胞或發育不良星形膠質細胞的神經結節更容易產生癲癇。

TSC癇性發作的機制與谷氨酸內環境功能失調有關。星形細胞特異性TSC1失活的小鼠表現為進展性癲癇，這可能是由於星形細胞谷氨酸轉運體(GLT-1和GLAST)表達降低和通過內向整流鉀通道攝取細胞外K+功能受損所致。這種與高致癇性的關係在GLT-1基因敲除小鼠中進一步證實，表明星形細胞突觸谷氨酸清除受損能夠增強興奮性突觸傳遞，進而增強了TSC的癲癇發生。

局灶性皮質發育不良的靶向治療

目前FCDs的治療仍主要為對症治療。因為FCD引起的癲癇發作經常對AEDs耐葯，所以需要癲癇手術治療。手術切除發育不良組織可使50%～80%的患者達到癲癇緩解，與FCDs類型、年齡和切除的方式有關。但是，相當一部分患者在術後仍有發作，且一小部分患者合併術後併發症。因此，目前仍需要新的基於分子水平的治療。

由於mTOR參與除了FCD以外的多種人類疾病，研究者不斷努力探求靶向mTOR信號通路的方法。目前使用最多的抑制mTOR的藥物為雷帕黴素類似物，包括雷帕黴素及其類似物西羅莫司和依維莫司。這些抑制物特異性作用於mTORC1，降低其下游效應器的生理作用，阻止異常細胞生長，突觸發芽和神經元固有興奮性增高伴mTOR信號通路激活。就這點而言，雷帕黴素慢性給葯能通過阻滯突觸電活動、降低AMPA受體表達及增加GABAA受體介導的神經傳導，從而降低皮質興奮性。此外，雷帕黴素也通過延長Ca2+依賴K+通道開放時間，增加皮質及海馬神經元電壓門控鉀通道Kv1.1表達，降低神經元固有興奮性。

雷帕黴素潛在的抗癲癇作用已經在皮質發育不良動物模型中進行評估。在滅活TSC1小鼠中，早期使用雷帕黴素能防止癲癇發作和過早死亡，而後期使用可減少癲癇發作並延長生存率。而且雷帕黴素在TSC2失活性突變小鼠中使用可改善突觸可塑性和行為缺陷。在PTEN敲除小鼠中，雷帕黴素顯著抑制癇性發作的嚴重程度和持續時間，防止神經元過度肥大並延長其存活率。雷帕黴素已成功用於mTOR相關疾病，例如，雷帕黴素能防止細胞系遷移缺損。然而這一理想的效果未在其他動物模型中觀察到。例如，雷帕黴素不能減弱匹羅卡品誘導的癇性發作嚴重程度及頻率。這表明mTOR信號通路的激活可能不是所有癲癇類型的關鍵機制，因此，雷帕黴素可能不產生廣譜抗癲癇作用。

按照推論，mTOR抑製劑近期被用於FCDs患者中。例如，雷帕黴素的使用明顯降低一例患有TSC的兒童癇性發作時間和頻率，且在一個開放性研究中發現能減少TSC患者室管膜下巨大星形細胞瘤(Subependymal giant astrocytomas，SEGAs)大小。另一方面，在PMSE患者中雷帕黴素明顯降低癲癇發作頻率並提高接受性語言能力。然而大規模試驗需評估雷帕黴素的效能和不良反應，尤其是FCDs患者。

其他的治療方法仍處於研究階段。例如，MDR1抑製劑(維拉帕米)在難治性癲癇患者中使用，可部分減弱癲癇發作頻率和嚴重程度。部分FCDs患者中使用維拉帕米有利於癲癇控制。在另一方面，雷帕黴素合併RAF-MEK抑製劑可能是神經節膠質瘤的潛在治療方法，因為這一靶向治療和結腸癌這兩條通路顯著降低腫瘤細胞存活率。最近病毒感染與FCDs之間的關係為發現其他治療方法提供新思路。總之，FCDs分子機制的新進展為精準醫療提供可能，可針對每種疾病中特定的靶向特定信號通路，離子通道，神經遞質受體或轉運蛋白，因而將相關副反應降至最低。

展望

FCDs因其可能的因果異質性，對患者神經功能的影響和缺乏精確的治療方式仍然是臨床醫生的挑戰。發現mTOR信號通路在FCDs和其他皮質畸形的機制中作用為有效的治療方式提供了可能。儘管mTOR抑製劑在動物模型和患者癲癇控制中取得結果較好，目前仍需要大規模隨機對照試驗評估其效能和長期副反應，尤其是在FCDs患者中。並且，在FCDs腦組織切片中檢測到病毒病原體有利於理解這些病變的機制，發現新的預防、診斷和治療方法。為此，接下來的研究需證實病毒在皮質發育不良中的致病作用，並解答傳播途徑，流行時機和傳播機制等問題。在另一方面，FCDⅠ、Ⅲ型的病因異質性提示有多種可能的致病機制。然而其解剖上和臨床表現上的共同點仍難理解並成為未來需要解決的重要挑戰。

END

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