基於 SMRT 測序技術對 CRISPR-Cas9 基因編輯技術的安全評估——基因編輯或具有癌症風險

7月16日Nature Biotechnology雜誌發表了一篇有關基因編輯的最新研究文章。該研究表明，目前受到廣泛關注的靶向CRISPR-Cas9編輯技術會引起基因組中廣泛的大型片段缺失，以及複雜的基因組重排，並且這些變化往往涉及數以千計的鹼基。而這些基因組的損傷變化可能還會導致疾病。

長期以來，眾多研究人員以及相關應用的公司一直都在關注基於CRISPR的基因編輯技術，並致力於將其轉化為治療人類疾病的多種治療手段。而今天所要向大家介紹的這一篇文章，則藉助PacBio SMRT長度長測序技術，報道了基於CRISPR的基因編輯技術所帶來的脫靶問題。

這篇文章的作者來自國際知名的Wellcome Sanger研究所，Allan Bradley教授。他是研究腫瘤抑制基因p53的權威之一，發表的論文共被引用近80000次。

知名生物學家Allan Bradley教授

（圖片來源：Wellcome Sanger研究所）

通過改造Cas9酶，改進相應的實驗protocol從而減少CRISPR-Cas9編輯技術的脫靶效應而帶來的損傷。通常，大多數靶向的Cas9效應會導致少於20bp的indels變化，更複雜的缺失現象則更為罕見。在以往的結論中，通常會認為CRISPR-Cas9具有相當的特異性。然而，來自Cas9介導的基因組變化，往往僅通過對靶向區域，或潛在脫靶區域中，片段較短區域（

基於這樣的技術局限性，作者推測，由於對CRISPR-Cas9編輯技術的評估來自基因組中短片段的分析，很可能錯過了由靶向Cas9切割和修復產生的大部分潛在基因型變化。在對大量具有絲分裂活性的體細胞編輯時，部分這些基因型變化後則可能具有潛在的致病性。

為了驗證這一想法，文章作者Allan Bradley及其團隊對在X連鎖的PigA基因座上，由Cas9介導的等位基因多樣性進行了研究。X連鎖的PigA基因座在雄性胚胎干（ES）細胞中為半合子，針對內含子和外顯子PigA位點，他們將Cas9和guide RNA引入小鼠ES細胞中，並發現靶向2號至4號外顯子的單個gRNA發生PigA完全丟失的比例為59％-97％。此外，靶向內含子位點的單個gRNA也導致PigA缺陷細胞以顯著的頻率產生。距離最近的外顯子263bp到520bp的10個不同的guide，引起了PigA出現8％-20％的丟失，而兩個大於2kb的guide則引起了5％-7％的丟失。

圖1：在小鼠ES細胞中用外顯子和內含子gRNA編輯時PigA丟失的頻率。（a）實驗設計;（b）通過FLAER染色顯示的PigA編輯的實例;（c）具有內含子和外顯子gRNA的Cas9引起的PigA損失的頻率

為了弄明白PigA缺陷細胞究竟發生了怎樣的遺傳學變化，作者選擇了經過3種gRNA編輯的細胞，對其2號外顯子進行了5.7kb區域的擴增，並將擴增產物在PacBio SMRT測序平台上進行測序。作者發現「我們觀察到切割位點周圍的reads出現了kb級別的覆蓋率減少，這與出現大型缺失的現象一致。這些細胞中最常見的變化是遠離外顯子的地方，其上游或下游延伸出現數以千計鹼基的缺失。」作者得出結論「在大多數情況下，PigA表達的喪失可能是由外顯子的丟失引起的，而不是內含子調控元件出現了損傷。」

圖2：對選擇性gRNA編輯的PigA基因座進行分析。

圖3：小鼠ES細胞常染色體Cd9位點Cas9編輯分析。

作者對PacBio reads進行分類，發現了用三種不同的gRNA編輯產生的183個獨特的高質量等位基因，出現了從簡單的缺失插入到複雜重排的變化。

圖4：多條gRNA都能帶來潛在的DNA刪除或插入變異風險

為了研究觀察到的靶向DNA修復相關損傷是否是未分化小鼠ES細胞的特性，文章作者Bradley等人在分化的人類細胞系中繼續進行了後續的實驗。他們發現，在該細胞系中PigA編輯所導致的基因丟失，其頻率與在小鼠ES細胞中觀察到的頻率相當。後續作者也證實，「廣泛的靶向基因組損傷在所有的基因座以及細胞系的檢測中都是普遍存在的結果。甚至，觀察到的遺傳學變化並不局限於目標基因座，因為諸如雜合性缺失之類的事件將揭示隱性等位基因，而易位，倒位和缺失將引起長距離轉錄的結果，」作者總結道。「一個靶向基因座可能具有轉錄活性，而這一突變如果與數百種癌症驅動基因中的一種發生並列，則可能引起腫瘤的發生。」

這篇文章的第一作者，Michael Kosicki談到：「最初，我們的實驗是使用CRISPR-Cas9研究基因的活性，但卻獲得了額外的發現。當我們發現了這種基因組的複雜重排，我們對其進行了系統地研究，觀察不同的基因以及不同治療相關的細胞系，結果表明CRISPR-Cas9確實產生了這些不良的後果。」

原文信息：

Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements

Nature Biotechnology

Michael Kosicki, K?rt Tomberg & Allan Bradley

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