ACS NANO：基於仿生周期納米結構輔助滾環擴增的超靈敏診斷生物晶元

引言

疾病的早期診斷可以顯著降低死亡率並提高存活率，生物活性小分子(包括核酸、蛋白質、糖等)在疾病的早期診斷中起著至關重要的作用。miRNA參與基因表達調控的各種生物過程，例如細胞生長、增殖以及凋亡等，是具有診斷和預後價值的潛在生物標誌物。滾環擴增(RCA)是一種等溫信號擴增方法，可以實現信號的千倍放大，在檢測DNA、RNA和蛋白質方面具有巨大潛力。儘管如此，RCA在檢測miRNA方面仍然存在挑戰，比如標準RCA的檢出限僅為fM級，無法達到檢測臨床樣本中miRNA的標準，因此，開發一種能夠提高RCA靈敏度並用來直接檢測血清中miRNA的方法在疾病的早期診斷中具有重要價值。

成果簡介

近日，武漢大學周翔教授和袁荃教授在上發表題為「An Ultrasensitive Diagnostic Biochip Based on Biomimetic Periodic Nanostructure-Assisted Rolling Circle Amplification」的研究論文。文章構建了一種光子晶體輔助滾環擴增(PCs-RCA)的生物晶元用於超靈敏檢測血清中的miRNA。該生物晶元將PCs表面增強光學信號的能力與RCA的信號放大相結合，從而有效提高檢測靈敏度，其檢測限低至0.7aM，相比標準RCA降低了7個數量級。

圖文解讀

圖1 mi-RNA響應的PCs-RCA生物晶元的示意圖。靶標miRNA作模板連接padlock探針並進一步啟動RCA反應產生長雙鏈DNA(dsDNA)，SYBR Green I（SG）分子特異性結合dsDNA產生熒光信號，PCs的光子帶隙與SG分子的發射帶之間的重疊可以顯著增強PCs表面上SGdsDNA的熒光強度，進而提高RCA的檢測靈敏度。

圖2 (a)PCs在光照下的照片以及PCs的周期性納米結構的SEM圖像。親水性聚苯乙烯（PS）在疏水性聚二甲基硅烷（PDMS）基底上通過蒸發自組裝形成金木堆積的周期性納米結構，當PCs暴露在光線下，可以在觀察到亮綠色，表明在PCs表面可以有效地發射綠光；(b)PCs的透射光譜以及SG和FAM的熒光光譜圖。PCs的光子帶隙覆蓋500~570nm，與其表面選擇性反射綠光現象一致，SG和FAM的發射帶與PCs的光子帶隙很好的重疊，證明PCs表面能很好的反射綠色熒光團的熒光信號。

圖3 (a)對比PDMS以及PCs基底對於FAM-DNA溶液的熒光增強效果示意圖；(b)紫外燈激發FAM-DNA在裸PDMS和PC表面上的照片，表明PCs表面的仿生周期性納米結構可以有效地增強FAM-DNA的熒光強度；(c)使用PE Spectrum and Quantum FX成像系統捕獲PDMS和PCs表面上FAM-DNA的熒光圖像；(d)對比PCs表面對於不同有機染料包括FAM、TAMRA和Cy5的熒光增強效果，結果表明對於FAM的熒光增強效果最好，這是因為AM發射光譜能與PCs的光子帶隙發生良好的重疊。

圖4 (a)以let-7a為靶標miRNA，觀察不同let-7a濃度發生RCA反應在PCs/PDMS表面的熒光圖像。可以觀察到在相同濃度下在PCs表面發生RCA反應具有更強的熒光；(b)熒光強度與let-7a miRNA濃度之間的關係圖。PCs-RCA的LOD為0.7aM，這比標準RCA(10fM)低近5個數量級，表明該方法檢測miRNA具有高靈敏度。

圖5 PCs-RCA生物晶元的特異性探究。在這些miRNA中，let-7a，let-7c和let-7f的序列在不同位點僅相差一個鹼基，結果顯示let-7a表現出更高的熒光強度，這表明PCs-RCA生物晶元可以有效地區分甚至單鹼基差異的miRNA。

圖6 (a)添加let-7a miRNA-FBS溶液的PCs-RCA生物晶元的熒光圖像；(b) let-7a miRNA濃度與熒光強度的線性相關性；(c~d)分別添加健康血清樣本和非小細胞肺癌(NSCLC)患者的血清樣本的PCs-RCA生物晶元的熒光圖像以及相應的熒光強度分析。這些結果表明PCs-RCA生物晶元不受血清中背景化合物的顯著影響，能直接分析臨床樣本中低丰度生物活性分子，具有良好的應用前景。

圖7 PCs-RCA生物晶元在分析臨床樣本中可靠性驗證。用RT-qPCR平行測量血清樣品中let-7a miRNA的濃度，PCs-RCA生物晶元和RT-qPCR的定量結果一致，表明該方法在臨床樣本的miRNA檢測中是高度可靠的。

總結與展望

作者通過設計PCs輔助RCA反應開發了一種超靈敏的生物晶元，實現了大規模信號放大並用於血清中miRNA的檢測。PCs-RCA生物晶元可以高靈敏檢測目標miRNA，LOD低至0.7Am。此外，該晶元具有優異的特異性，並且可以區分具有單個鹼基差異的miRNA。總而言之，作者開發的這種PCs-RCA生物晶元在生物活性分子的超靈敏檢測方面具有巨大的潛力，並可進一步促進疾病診斷和健康評估等領域的發展。

文獻鏈接

DOI: 10.1021/acsnano.8b01950

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.8b01950

團隊介紹

周翔，教授，博士生導師。

教育與研究經歷

1982.9-1989.7學士，碩士，武漢大學化學系

1989.7-1992.12助教，講師，武漢大學化學系

1992.12-1995.5博士，香港中文大學化學系

1996.10-1998.10博士後，美國Department of Chemistry, University of Virginia,Professor Dr. S. M. Hecht課題組

1998.11-2001.5博士後，美國Department of Chemistry and Biochemistry, University ofMaryland, College Park, Professor Dr. S. E. Rokita課題組

2001.5--至今教授，博導,武漢大學化學與分子科學學院

2009--至今教育部長江學者特聘教授

2011年973首席科學家

研究領域與興趣

生物有機化學、藥物化學和化學生物學

課題組主頁：

http://xiangzhou.whu.edu.cn/

袁荃，教授，博士生導師。

教育背景：

2000年09月- 2004年7月：武漢大學化學學士學位

2004年09月- 2009年7月：北京大學無機化學博士學位 導師：嚴純華院士

2009年09月- 2011年12月：佛羅里達大學化學系博士後 合作導師：譚蔚泓院士

研究領域：

1.多功能納米材料的設計與製備

2.基於DNA的納米複合材料在生物醫學領域的應用

3.基於光學納米材料的分析檢測和生物成像

學術成果：

以第一/通訊作者發表SCI源刊論文55篇（IF>10論文16篇），包括Proc. Natl. Acad. Sci. 1篇, J. Am. Chem. Soc. 4篇, Angew. Chem. Int. Ed. 2篇, Adv. Mater. 2篇, ACS Nano 5篇, Adv. Funct. Mater. 2篇，Adv. Sci. 1篇。

課題組主頁

http://quanyuan.whu.edu.cn/

編輯：Kumquat Lemon

審核：Flixews

推送：蜂蜜柚子茶

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