復旦團隊揭示孤獨症相關基因CHD8在少突膠質細胞發育、髓鞘形成和損傷後修復中的作用機理

責編丨迦 漵

孤獨症（autism spectrum disorders, ASD）是一類基因型和表型複雜的病因異質性疾病。近來研究發現，CHD8基因突變與孤獨症密切相關，被認為是孤獨症高度易感基因之一【1】。CHD8基因屬於SNF2H樣ATP依賴染色質重塑子CHD家族（chromodomain helicase DNA-binding (CHD) family of SNF2H-like ATP-dependent chromatin remodelers），CHD8基因突變可導致先天發育異常，包括生長遲緩和智力障礙。孤獨症患兒被發現常伴有中樞神經系統白質發育異常【2】，這些發現提示CHD8可能參與中樞神經系統髓鞘形成細胞發育和髓鞘形成。

少突膠質細胞（Oligodendrocytes）參與的髓鞘形成是中樞神經系統完成正常跳躍式神經傳導所必需的。髓鞘形成和再生障礙缺陷將引起神經傳導障礙和功能缺失，導致認知、行為和運動功能障礙【3】。少突膠質前體細胞（Oligodendrocyte precursor cells,OPCs）由中樞神經系統神經前體細胞發育而來，經增殖、分化形成成熟的少突膠質細胞。染色質修飾和重塑是少突膠質細胞分化過程中的關鍵步驟，其調控異常可引發神經系統疾病【4】。

儘管目前通過雜合CHD8+/-動物和宮內基因敲除實驗發現CHD8廣泛表達於發育大腦中的神經元和膠質細胞，並且影響神經發育、功能和行為【5，6】，但是對於CHD8細胞特異性功能尚未得到解決。CHD8突變的孤獨症患者表現為嚴重的白質異常，然而其髓鞘形成異常是由細胞自主性（cell-autonomous）還是非細胞自主性（cell non-autonomous）CHD8突變導致尚未得到證實。

6月18日，來自復旦大學附屬兒科醫院的周文浩課題組和辛辛那提兒童醫院醫學中心的Qing Richard Lu課題組在Developmental Cell雜誌上聯合發表了題為Dual-requirement of CHD8 for Chromatin Landscape Establishment and Histone Methyltransferase Recruitment to Promote CNS Myelination and Repair的論文。文章證實了少突膠質前體細胞特異性Chd8缺失可引起中樞神經系統髓鞘形成障礙，揭示了CHD8在少突膠質細胞發育、髓鞘形成和損傷後修復中的細胞內在依賴性。這為CHD8相關白質缺陷疾病治療提供了分子層面的研究基礎。

研究人員首先在CHD8基因突變孤獨症患兒頭顱MRI結果中發現與同齡大腦相比，這些患兒表現為嚴重的大腦白質缺陷和體積減少。研究人員發現在P14小鼠胼胝體、視神經和脊髓中大部分CHD8+細胞為CC1+分化少突膠質細胞，在發育期白質中CHD8高表達於少突膠質細胞系中，且CHD8在OPC中的表達高於成熟少突膠質細胞。

為了在體內研究CHD8對中樞神經系統髓鞘形成的特異性作用，研究人員建立了Chd8條件性基因敲除小鼠（Chd8cKO），通過與Olig1-Cre小鼠相交，在少突膠質祖細胞中敲除Chd8基因。所有Chd8cKO小鼠髓鞘發育嚴重紊亂，出生後3周左右開始出現後肢緊扣、全身震顫和強直性陣攣發作，出生後21天左右死亡。P14天Chd8cKO小鼠視神經相較對照組小鼠透明，P1和P14Chd8cKO小鼠髓鞘形成基因表達均較對照組小鼠低，證實CHD8基因缺失致發育期中樞神經系統髓鞘形成障礙。

Chd8cKO小鼠髓鞘形成缺陷可能與OPC生成相關。然而，在Chd8cKO小鼠與對照組小鼠大腦中未發現PDGFR+少突膠質前體細胞數量差異。相反，在髓鞘中，從E14.5到P14Chd8cKO小鼠OPC數量較對照組小鼠明顯降低。細胞增殖實驗結果發現Chd8cKO小鼠髓鞘OPC增殖明顯受到抑制。結果證實在中樞神經系統OPC發育過程中CHD8表達具有區域特異性。

研究人員發現，在OPC中敲除CHD8基因可抑制OPC分化，引起OPC凋亡。然而，通過神經元特異性Cre在神經元中敲除CHD8基因並不影響OPC的發育分化，提示CHD8調控OPC分化是細胞自主性的（cell-autonomous）。

通過在小鼠背側脊髓注射溶血卵磷脂（lysolecithin, LPC）可誘導局灶性脊髓脫髓鞘模型。在正常成人脊髓少突膠質細胞中CHD8很少表達，而在髓鞘再生病灶中CHD8表達增加。在Chd8cKO小鼠脫髓鞘模型中發現，在脫髓鞘病灶中OPC增殖明顯受到抑制，CC1+分化少突膠質細胞數量明顯減少，電鏡結果發現髓鞘化軸突數量顯著降低。結果證實，在髓鞘修復過程中，CHD8調控OPC增殖和再生，因此是脫髓鞘損傷後髓鞘再生所必需的。

轉錄組測序技術顯示，CHD8缺失導致與少突膠質細胞分化相關基因表達下調，而分化抑制基因，如P53信號通路、Wnt信號通路，表達上調。同時發現，甲基轉移酶KMT2/MLL靶基因和H3K4me3標記基因也明顯表達下調。染色質免疫共沉澱測序（ChIP-seq）數據顯示，CHD8在OPC中主要與基因啟動子或臨近的增強子區域相結合，且這些結合區域的基因序列與許多轉錄因子相吻合，包括Olig2和Sox10。研究者進一步結合Chd8敲除OPC的轉錄組測序數據分析，發現了1656個CHD8下游靶向調控基因，這些基因都作用於神經發生、膠質發生、少突膠質細胞發育和Wnt信號通路等生物學過程中。

同時，研究者還通過轉座酶可接近染色質測序（assay for transposase-accessible chromatin，ATAC-seq ）發現CHD8在OPC中對染色質結構的開放是必不可少的。特別是對於少突膠質細胞特異性基因Olig2和Ascl1，以及Olig1/2，Sox10等少突膠質細胞分化相關基因，染色質可接近程度在CHD8敲除OPC中顯著低於對照OPC。結合RNA-seq和H3K4me3 ChIP-seq數據，研究者發現CHD8是通過促進少突膠質細胞分化相關轉錄因子的染色質可接近程度從而調控OPC分化過程。

研究者發現CHD8通過募集KMT2/MLL組蛋白甲基轉移酶複合物激活OPC分化相關轉錄調控程序。組蛋白去甲基化酶KDM5可使 H3K4me3去甲基化，CPI-455是KDM5選擇性抑製劑，並且可通過血腦屏障。在大多數Chd8基因敲除OPC中H3K4me3缺失，而加入CPI-455後可顯著增加H3K4me3水平，並且MBP表達成熟少突膠質細胞數量明顯升高。Chd8cKO小鼠腹腔注射CPI-455後，發現成熟少突膠質細胞數量明顯增高。細胞和動物實驗結果發現，抑制KDM5組蛋白去甲基化酶活性能增加H3K4me3水平，提高Chd8基因缺失OPC分化能力。

總體來說，CHD8以細胞自主性方式調控少突膠質前體細胞增殖分化，髓鞘形成和損傷後髓鞘再生。CHD8激活BRG1相關SWI/SNF複合物表達，從而激活CHD7，起始染色質重塑和少突膠質細胞分化基因轉錄表達。同時CHD8募集MLL/KMT2組蛋白甲基轉移酶複合物促進少突膠質細胞分化。抑制去甲基化酶活性可部分挽救CHD8缺失引起的髓鞘形成缺陷。CHD8通過染色質重塑和募集H3K4組蛋白甲基轉移酶的雙重功能促進少突膠質細胞分化，這將為CHD8相關中樞神經系統白質損傷疾病，如ASD和多發性硬化，提供新的治療策略。

參考文獻：

1. Bernier, R., Golzio, C., Xiong, B., Stessman, H.A., Coe, B.P., Penn, O., Witherspoon, K., Gerdts, J., Baker, C., Vulto-van Silfhout, A.T., et al. (2014). Disruptive CHD8 mutations define a subtype of autism early in development.Cell158, 263-276.

2. Hardan, A.Y., Fung, L.K., Frazier, T., Berquist, S.W., Minshew, N.J., Keshavan, M.S., and Stanley, J.A. (2016). A proton spectroscopy study of white matter in children with autism.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry66, 48-53.

3. Franklin, R.J., and Goldman, S.A. (2015). Glia Disease and Repair-Remyelination.Cold Spring Harb Perspect Biol7, a020594.

4. Emery, B., and Lu, Q.R. (2015). Transcriptional and Epigenetic Regulation of Oligodendrocyte Development and Myelination in the Central Nervous System.Cold Spring Harb Perspect Biol7, a020461.

5. Cotney, J., Muhle, R.A., Sanders, S.J., Liu, L., Willsey, A.J., Niu, W., Liu, W., Klei, L., Lei, J., Yin, J., et al. (2015). The autism-associated chromatin modifier CHD8 regulates other autism risk genes during human neurodevelopment.Nat Commun6, 6404.

6. Platt, R.J., Zhou, Y., Slaymaker, I.M., Shetty, A.S., Weisbach, N.R., Kim, J.A., Sharma, J., Desai, M., Sood, S., Kempton, H.R., et al. (2017). Chd8 Mutation Leads to Autistic-like Behaviors and Impaired Striatal Circuits.Cell Rep19, 335-350.

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