「克隆猴」這一世界難題的破解標誌著我國動物克隆技術已居於國際領先地位。什麼是克隆? 克隆的理論基礎是什麼? 猴克隆的成功秘訣有哪些? 《科學通報》第18期封面文章特邀中科院動物研究所趙同標研究員解讀。
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趙同標，中國科學院動物研究所研究員, 博士生導師, 「青年千人計劃」入選者, 主要從事幹細胞免疫與幹細胞轉化工作。首次發現了誘導多能幹細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)的免疫原性, 解析了自噬在多能幹細胞調控中的關鍵作用, 組織撰寫了多項幹細胞標準草案並發布了我國第一個幹細胞通用標準—《幹細胞通用要求》。
進化和生理上最接近於人類的靈長類動物——獼猴(Macaca mulatta)被複制出來了, 你相信嗎? 科幻電影中克隆人的腳步似乎離我們越來越近了。2018年1月24日, 國際頂級生物學期刊Cell以封面文章的形式報道了一項振奮人心的重大成果: 中國科學院神經科學研究所孫強研究組採用體細胞核移植技術(somatic cell nuclear transfer, SCNT)成功克隆出兩隻食蟹猴「中中」和「華華」。「中中」、「華華」的誕生遠非僅為克隆動物家族多添一位成員那麼簡單。Cell主編Marcus的評述: 「該成果是一項令人興奮的、意義非凡的工作, 是全世界同行科學家花了20多年時間才達到的里程碑。它有潛力引發動物研究的革命並幫助研發治療人類疾病的新方法」。克隆猴「中中」和「華華」的誕生標誌著我國在克隆技術領域已處於世界最前沿, 與之相關的轉化醫學研究也有望進入國際領跑階段。
克隆猴是如何被克隆出來的呢? 《西遊記》中從花果山巨石下跳出來的那隻石猴——「齊天大聖」孫悟空有著超凡的能力: 隨便從身上拔一把毫毛, 吹一口仙氣, 一群「齊天大聖」就降臨了。
提到克隆動物, 自然而然會聯想到1996年誕生的克隆羊「多莉」。作為首隻被克隆出的哺乳動物, 「多莉」成為動物界最耀眼的明星, 同時也讓「克隆」這一概念深入人心。「克隆」是一種無性繁殖的手段。狹義來講, 克隆就是通過將某種動物的體細胞核植入去核的卵母細胞, 在體外培育成囊胚後再植入代孕母體, 最終產生與供體細胞核遺傳信息完全一致的新個體的過程。所用到的技術為體細胞核移植技術, 也稱為體細胞克隆技術。該過程直接利用體細胞核與卵母細胞質相結合的方式產生動物個體, 巧妙地避開了精子和卵子的受精融合過程。
眾所周知, 高等動物的正常發育是從受精卵開始, 經歷一系列增殖分化和胚胎髮育, 最終形成具有生命的完整個體。在這一過程中, 受精卵細胞不斷地擴增壯大、不停地「改頭換面」。那麼, 已經終末分化的成體細胞是否能夠重新回到原初狀態, 再次發育為各種各樣的細胞類型, 擔當起構築新生命大廈的使命? 換句話說, 即將走向死亡的成熟細胞如表皮細胞、血液細胞等能否實現「返老還童」, 重新「華麗轉身」, 並進而繼續成為維持生命系統的重要角色? 要想回答這些問題必須從細胞核的全能性談起。
很早之前, 人類就已經知道植物具有與生俱來的超強再生能力, 一根枝條插入泥土就可生長成一顆新的植株; 動物界某些生物亦具有再生能力, 如蚯蚓斷掉一截後可再生長出另一半等, 但更高等的動物似乎丟失了這種再生的「超能力」。
為了回答這個問題, 長期以來科學家一直進行著不懈的努力。直到1938年德國胚胎學家Spemann報道了一個簡單而又巧妙的試驗, 為回答這一問題帶來了曙光(圖 1)。他用頭髮將蠑螈(Cynops)的受精卵結紮成兩部分, 並把細胞核推移到一側, 結果發現, 只有帶核的B側(圖 1)受精卵能夠向胚胎髮育, 而A側無核受精卵則處在發育停滯狀態; 但如果將經過幾次分裂的細胞核重新推移到A側, 則該側受精卵亦重新開始分裂並能發育成個體, 而且該個體比B側受精卵發育的個體更顯年輕態。這個操作簡單的開創性試驗首次提示: 經過幾次分裂並初步分化了的動物細胞核依然具有發育成完整個體的能力。隨後, Spemann進一步提出了將發育相對較後時期的細胞核移植到去核的卵細胞中, 研究其是否能夠完成整個發育過程。這將會是一個激動人心的試驗, 然而在他的有生之年並未完成這個試驗。這是最早的關於分化了的體細胞細胞核依然具有全能性探索的記載, 亦是體細胞克隆技術的最初萌芽。
利用體細胞克隆技術進行動物克隆最早是在青蛙(Rana nigromaculata)上實現的。青蛙的卵細胞大而明顯, 易於操作, 此外青蛙是在體外受精和胚胎髮育的, 這些特徵使得青蛙成為進行核移植和動物克隆的理想模型。Hans Spemann的受精卵橫縊試驗在當時的確是天才般的設想, 然而似乎在科學探索的世界裡無論你多聰明, 總會有人能同你想到一起。距離Spemann最初提出的核移植實驗萌芽的14年後, Briggs於1952年完成了類似的試驗設計, 他和King一起將青蛙的囊胚期細胞的細胞核移植到去核的卵細胞, 成功獲得了正常發育的蝌蚪, 完成了人類歷史上首次核移植動物克隆試驗。隨後, 1958年, 約翰· 戈登(John Gurdon)應用同樣策略成功地以蝌蚪的末端分化的腸上皮細胞的細胞核為供體克隆了青蛙, 首次證明了末端分化的成熟體細胞的細胞核也具有發育的全能性。這個試驗改變了當時領域內普遍認為的末端分化的體細胞(發育上即將走向死亡的細胞)不具備發育全能性的錯誤觀點。此後, 採用相同的方法魚(Piscium)被成功克隆。
然而, 上述這些動物都是體外受精和體外發育, 生殖發育方式與高等動物存在巨大區別, 因而在當時並未引起科學界的普遍關注。直到1996年, Campbell研究組利用乳腺細胞成功克隆綿羊(Ovis aries)——「多莉」, 動物克隆才在世界範圍內引起了轟動。與青蛙的克隆不同, 羊等高等哺乳動物胚胎髮育是在母體子宮中進行的, 因此大大增加了實驗的難度。儘管如此, 隨著技術的不斷進步, 「多莉」羊誕生後, 多種高等哺乳動物已被成功克隆: 小鼠(Mus musculus)和奶牛(Bos taurus)(1998)、山羊(Capra aegagrus)(1999)、豬(Sus scrofa)(2000)、大鼠(Rattus norvegicus)、馬(Equus ferus)、騾子(Equus mulus)(2003)、狗(Canis lupus)(2005)等。
至此, 對體細胞克隆技術有了初步了解, 然而新的疑惑也接踵而來: 「全能」的動物細胞核為什麼在體細胞中偃旗息鼓, 而在卵子提供細胞質的情況下能大顯身手?
顯然, 卵子細胞質中隱藏著某些神奇的因子能夠使得成熟體細胞的細胞核「返老還童」, 並重新賦予其發育成完整個體的「超能力」(圖 2(a))。無獨有偶, 多能幹細胞融合實驗也給出類似的提示。1976年, 科學家Miller和Ruddle將胚胎癌細胞和胸腺細胞融合後, 發現產生的雜交細胞擁有類似胚胎癌細胞的表型並能向 3 個胚層分化。隨後, 日本和美國的科學家分別將小鼠的胸腺細胞和胚胎幹細胞、人成纖維細胞和胚胎幹細胞相融合, 發現融合的四倍體細胞亦具有胚胎幹細胞特徵。上述試驗充分說明類似於卵母細胞, 胚胎幹細胞和胚胎癌細胞的細胞質中也存在著某些「年輕因子」, 這些因子能夠幫助成熟體細胞實現「返老還童」(圖2(b))。
這些發現顛覆了人們傳統認為「發育是一個不可逆轉的基因水平變化的過程」的錯誤觀點, 提示發育是一個可以逆轉的表觀遺傳變化的過程。隨著科學技術的飛速發展和研究的不斷深入, 科學家們對細胞核全能性的理解也更加全面: 無論是發育早期的受精卵還是處於發育末期的成熟體細胞的細胞核都具有全能性, 然而細胞核的狀態會隨著發育分化而改變, 其DNA甲基化、組蛋白甲基化及乙醯化等多種表觀遺傳修飾都發生相應的變化, 從而使得分化細胞的細胞核的全能性處於「休眠」狀態。卵子細胞質或多能幹細胞細胞質中存在的某些「年輕因子」能夠擦除這些表觀遺傳印記, 使細胞核擺脫束縛, 重塑自我, 最終實現全能性的重新激活。
那麼,這些能夠實現「返老還童」永葆青春的「年輕因子」到底是什麼?人類能否找到甚至利用這些因子直接實現成熟體細胞的年輕化? 答案似乎並沒有那麼簡單。
圖2SCNT(a)與細胞融合(b)提示卵母細胞和胚胎幹細胞的胞質中存在「年輕因子」
細胞雖小, 但結構極其複雜, 細胞中充滿了形形色色的DNA, RNA, 蛋白質等, 將其比作浩瀚的宇宙一點兒不為過。而要在這浩如煙海的細胞宇宙中尋找到能夠實現「返老還童」的「靈丹妙藥」談何容易! 無數科學家為此進行了長期不懈的探索, 最終幸運之星降臨於日本科學家山中伸彌(Shinya Yamanaka)。通過對24個多能性調控關鍵轉錄因子的篩選, 山中伸彌研究組發現僅用 4 個轉錄因子Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc就能實現成熟體細胞的「返老還童」! 整個科學界為之沸騰! 為此, 山中伸彌同約翰· 戈登共同分享了 2012年的諾貝爾生理學或醫學獎, 以表彰他們在成熟細胞「返老還童」研究中的卓越貢獻。
隨著進化樹上動物等級的升高, 其生命維持機制越來越複雜, 其研究亦越來越困難。事實上在「多莉」羊誕生之前, 科學家們就已經開始了克隆猴的嘗試, 但進展緩慢。
1997年, Wolf研究組利用卵裂球的細胞核成功獲得了「克隆猴」。然而卵裂球是受精卵初始分裂得到的早期胚胎, 細胞尚處於全能性狀態, 因而並不屬於分化了的體細胞「返老還童」的範疇。2000年, 美國科學家將早期猴胚胎分割, 分割後的胚胎分別能發育成猴個體, 這種方法獲得的「克隆猴」並不是上述文中所定義的體細胞克隆猴, 亦未實現成熟體細胞的年輕化。直到2007年, Wolf的學生Mitalipov研究組成功地通過SCNT技術構建了猴的克隆胚胎幹細胞系, 成為第一個克隆出猴胚胎的科學家。Mitalipov一直致力於靈長類克隆, 曾被認為是世界上最有希望克隆猴的人, 但其最成功的一次克隆也以81 d胚胎猴的流產而告終。克隆猴成了世界級難題, 甚至被認為是現有技術不可能實現的。
首先，是靈長類自身生物學特性的原因。靈長類的卵母細胞不透明, 去核難度大, 需要精湛的操作技巧。劉真博士正是憑藉長期卓越的訓練, 練就了10 s去核、15 s注核的嫻熟手法。此外, 靈長類的卵細胞非常敏感, 極易提前激活。2007年, Mitalipov等人發現使用咖啡因可以暫時抑制某些信號通路, 降低卵母細胞的敏感性。但出於咖啡因具有毒性的顧慮, 孫強研究組採用了一種壓電驅動(piezo-driven)的顯微操作方法, 避免了對卵細胞的擠壓, 使細胞所受損傷減到最小。
其次，成本高以及倫理限制等問題也是阻礙克隆猴研究進展的重要因素。作為實驗動物的靈長類本身數量少, 卵子不易獲取, 難以進行大規模嘗試; 高額的實驗費用也限制了猴模型研究的規模化發展。同時, 靈長類試驗的倫理審查極為嚴格, 特別是歐美等動物保護意識強烈的國家和地區, 這在一定程度上使靈長類克隆的腳步受到延滯。
最後，也是最重要的原因是我們對體細胞重編程機制缺乏深入的理解。以往經典的克隆方法往往忽視了從體細胞重編程機制上尋找對策, 常常因為細胞核重編程不完全導致克隆胎兒發育異常從而頻頻流產。2014年, 華裔科學家張毅研究組發現, 基因組上大量存在的H3K9三甲基化是阻礙胚胎克隆的巨大障礙, 而這些障礙可以被H3K9me3去甲基化酶Kdm4d所消除, 從而提高SCNT效率。同濟大學高紹榮研究組也發現, 聯用Kdm4b和Kdm5b處理克隆胚胎顯著提高了小鼠克隆囊胚的發育率。此外早在2006年, 科學家發現組蛋白去乙醯化抑製劑曲古柳菌素(Trichostatin A, TSA)處理能夠使小鼠克隆成功率提高5倍以上。正是基於這些前期重編程機制的研究成果, 孫強研究組找到了Kdm4d和TSA的合適配比用量, 一舉攻破了這一世界難題(圖3)。
克隆猴的成功一方面證明了靈長類動物是可以被克隆的, 另一方面為探索更接近於人類生理病理機制的生命醫學動物模型的研發掀開了新篇章。中國科學院神經科學研究所所長蒲慕明表示: 「體細胞克隆猴的成功將推動中國率先發展出基於非人靈長類疾病動物模型的全新醫藥研發產業鏈, 促進針對阿爾茨海默症、自閉症等腦疾病, 以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新葯研發進程, 同時也讓中國成為世界腦科學人才的匯聚高地。」 事實上, 體細胞克隆猴的成功不僅在腦科學的研究領域具有重要意義, 而且在細胞治療、移植免疫、器官再造及譜系發育等諸多生命科學研究領域具有巨大的潛在應用價值。
伴隨著克隆猴的成功, 人們對「克隆人」的擔憂再度引起熱議。畢竟人與其他哺乳動物尤其是非人靈長類動物在生理結構上高度雷同, 非人靈長類的成功克隆進一步印證了克隆人理論上的可行性。鑒於巨大的倫理爭議, 早在克隆羊誕生後, 聯合國就通過協議和宣言禁止克隆人, 多數國家也以法律形式明確禁止人的生殖性克隆。生殖性克隆會引起一系列自身、家庭乃至社會等各個層面的種種問題, 也是倫理道德所不允許的。然而與之不同的是, 以臨床應用為目的的「治療性克隆」有著重大醫療價值和實踐意義, 將會為人類疾病治療提供嶄新的手段。早在2002年Jaenisch研究組採用核移植的方法重建了免疫缺陷小鼠的免疫功能, 實現了治療性克隆的概念性突破。而最近, 同樣採用體細胞核移植的方法Mitalipov研究組成功建立了人的克隆胚胎幹細胞系, 這無疑為體細胞克隆技術在人類疾病治療中的應用奠定了良好基礎。我們期待著克隆技術能夠在人類健康服務中大顯身手。
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