DNA編碼熒光實現細胞內RNA高通量成像

撰文 | 張曉兵

單位 | 湖南大學化學化工學院

清華大學化學系李景虹課題組在Chem上發表了題為「DNA-Sequence-encoded rolling circle amplicon for single-cell RNA imaging」的研究論文,《科學通報》特邀湖南大學張曉兵教授進行了點評。

單細胞RNA分析方法是單細胞生物學發展的基石。構建能夠高通量獲取細胞RNA表達水平、序列及空間分布等信息的單細胞RNA分析方法是目前單細胞分析領域面臨的巨大挑戰。近日,清華大學化學系李景虹課題組[1]在Chem上發表了題為「DNA-Sequence-encodedrolling circle amplicon for single-cell RNA imaging」的研究論文, 提出了一種基於核酸序列信息編碼的原位擴增標記方法, 實現了細胞內單分子、單鹼基分辨及高通量的原位RNA成像, 並利用該技術研究了乳腺癌發生相關基因的表達。

熒光成像技術是目前最有力的單細胞原位分析工具。受益於核酸探針合成、設計及成像技術的發展, 目前已有多種單分子水平的RNA熒光成像方法見諸報道, 包括單分子熒光原位雜交技術(smFISH)、滾環擴增技術(RCA)和支鏈DNA技術(bDNA)等[2]。這些單分子RNA成像技術能夠準確獲取細胞RNA表達量、序列及空間分布等信息, 但由於熒光基團的光譜重疊問題, 其檢測通量受到限制(一般只能同時成像3~4種目標)[2]。目前一般只能採用一種多次批量順序雜交標記的方法(sequential hybridization)來提高檢測通量[3], 但存在標記錯誤率難以控制、細胞檢測通量低等問題, 且操作繁瑣、周期長, 不利於推廣[4]。

李景虹課題組[1]發表的該項研究工作創造性地構建了核酸序列信息編碼熒光信號的新技術, 利用熒光光譜編碼方法顯著提高了細胞內RNA的成像通量。核酸ATCG鹼基是生命信息的載體, 是否能夠利用其豐富的分子信息編碼熒光信號？他們利用核酸最基本的性質——Watson- crick鹼基配對, 構建了基於核酸序列的熒光編碼方法(sequence-encoded amplicon, SeqEA), 並將其應用於細胞RNA高通量標記。該方法通過熱力學計算, 輔助設計核酸探針的編碼序列, 調控RNA識別擴增產物(編碼的擴增產物)與熒游標記探針的雜交效率, 從而構建出不同熒光信號強度的擴增產物, 用於不同RNA標記區分。這種被精確調控的編碼熒光信號能夠顯著提升RNA的標記數量。藉助於原位擴增技術,SeqEA能夠實現細胞內單分子、單鹼基分辨及高通量的原位RNA成像。SeqEA方法優勢在於: 不需要複雜的核酸結構設計, 只需要變動編碼序列的幾個鹼基就可以構造一個新的熒光編碼用於RNA標記。通過核酸雜交的計算和預測, 可以實現編碼信號的精準設計和調控。SeqEA的模塊化、可編程及序列編碼等特點使其能夠編碼出穩定的熒光信號並具備較高編碼潛力, 從而應用於RNA高通量檢測(圖1(a)~(c))。SeqEA能夠實現目標RNA及目標RNA特徵序列(如RNA剪切體)的高特異性區分和成像, 並可以檢測到細胞內表達量低至3拷貝的RNA。

圖1(a) DNA序列編碼擴增產物的熒光強度; (b, c) 兩種通道編碼擴增產物的熒光信號; (d) MCF-7細胞內多種mRNA同時成像; (e) 乳腺癌發生相關基因表達的相關性分析結果; (f) 細胞內mRNA位置與細胞核和細胞外周距離統計

該工作首次實現了細胞內原位的熒光光譜編碼, 並應用於細胞內單分子檢測。熒光光譜編碼方法通過結合不同熒光顏色和熒光強度對目標分子進行組合標記, 能有效提高熒游標記的通量, 並應用於體外高通量檢測。但是目前的熒光編碼尺寸太大(>1 mmol/L), 很難應用於細胞內標記[5]。SeqEA方法使用小尺寸鎖式DNA探針(~20nm)識別細胞RNA序列, 並利用原位滾環擴增技術放大識別信號, 從而產生可通過熒光成像讀取的帶編碼信號的擴增產物。原位核酸擴增技術的引入可以實現細胞內的熒光光譜編碼, 並實現單分子水平的RNA成像。同時藉助於鎖式DNA探針的高特異性,SeqEA方法能夠實現單鹼基分辨的胞內RNA檢測。

高通量的單細胞RNA原位分析方法可以用於細胞基因表達的異質性、相關性及空間分布特徵的研究。該工作研究發現, 所選取的9種跟乳腺癌發生相關的基因是爆髮式表達的(transcriptional burst), 並且KI67,Her2及ER基因的表達具有明顯相關性(圖1(d),(e))。在選取分析的基因中, 跟骨架組裝相關的基因PFN1和CFL1表達的RNA相對分布於細胞外周, 而細胞外分泌蛋白THBS1對應的mRNA傾向於分布於靠近細胞核位置(圖1(f))。這些結果表明, 單細胞水平RNA表達分析能夠用於共調控基因的發現及細胞基因表達通路的研究, 並且亞細胞水平基因表達的空間分布特徵可以被應用於基因功能的預測和輔助分析。

此項工作發展的SeqEA方法實現了細胞內RNA高特異性、高通量及精準定量的原位分析, 可以作為一個有競爭力的單細胞RNA分析平台, 用於基因表達調控通路、mRNA選擇性剪切、mRNA單鹼基變異及非編碼RNA(如miRNA,lncRNA及circRNA等)的同時成像分析, 也為構建高通量RNA成像方法提供了一種新思路。

相關論文

1. Deng R, Zhang K, Wang L, et al. DNA-sequence-encoded rollingcircle amplicon for single-cell RNA imaging. Chem, 2018, doi:10.1016/j.chempr.2018.1003.1003

2. Crosetto N, Bienko M, Van Oudenaarden A.Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nat Rev Genet, 2015, 16:57–66

3. Lubeck E, Coskun A F, Zhiyentayev T, et al. Single-cellin situRNA profiling by sequential hybridization. Nat Methods,2014, 11: 360–361

4. Chen K H, Boettiger A N, Moffitt J R, etal. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science, 2015, 348: aaa6090

5. Lin C, Jungmann R, Leifer A M, et al. Submicrometre geometricallyencoded fluorescent barcodes self-assembled from DNA. Nat Chem, 2012, 4: 832–839

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2018年，《科學通報》新增「亮點述評」欄目，簡要介紹國內外重要刊物上發表的亮點研究成果， 評介其創新點和對該領域研究的啟示(1~2個印刷面)。

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