飼用乳酸菌的分離篩選及益生性能評價

摘要：本研究從實驗室保存乳酸菌菌種中，通過耐酸耐膽鹽復篩，得到三株抗逆性能較好的乳酸菌，並對其人工腸胃液耐受能力，常見致病菌抑制能力進行了測定，實驗結果顯示，篩選所得3株菌株，經過10h人工腸胃液作用後，存活數量仍能夠達到發揮益生作用所需菌量，同時，其發酵液對大腸桿菌，沙門氏菌均有較強的抑菌能力。

關鍵詞：乳酸菌，益生性能，抑菌能力

畜牧業的基礎是飼料，綠色畜牧產品的生產依賴於優質無污染的飼料[1]。飼料污染不僅對綠色畜牧產品的生產造成影響，而且對畜禽健康和養殖業持續發展影響嚴重[2]。自青黴素被發現和應用以來，抗生素在預防、控制和治療人和動物感染疾病方面發揮了巨大的作用[3]。

隨著細菌抗生素耐藥性的產生及抗生素殘留問題日益嚴重，研究新的抗生素替代物越來越受到人們的關注，大量研究表明，微生物製劑、酶製劑、益生元、抗菌肽、酸化劑等新型飼料添加劑的使用能有效減少或者替代飼用抗生素的使用。微生物製劑作為一種潛力巨大的抗生素替代物，已成為全球畜牧業研究的重點。

乳酸菌作為新興的微生態製劑菌種，是一類可發酵糖類產生大量乳酸的細菌統稱，是一類對動物有益的益生菌群，它能夠阻止病原菌對腸道的入侵和定植，抑制病原菌和抗感染，維持腸道的微生態平衡，預防和抑制腫瘤的發生，增強機體免疫力，在不同培養條件下，乳酸菌發酵產生有機酸、過氧化氫、胞外多糖和細菌素等代謝產物。這些物質具有抑制病原菌和腐敗菌、提高免疫力（Kimura K等，1997）[4]和改善畜產品品質等生理功效（楊麗傑等，2004）[5]。

本研究從實驗室保藏的7株乳酸菌，通過耐酸耐膽鹽實驗初篩，得到3株性狀優良菌種，並對這3株菌株進行了模擬腸液、胃液耐受性試驗及致病菌的抑菌實驗，為該3株菌的飼用微生態製劑製備提供了一定的理論依據。

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實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

乳酸菌：屎腸球菌、糞腸球菌、植物乳桿菌，由北京好實沃生物技術有限公司研發中心提供。

致病菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella），保藏於北京好實沃生物技術有限公司研發中心。

1.1.2 培養基

MRS培養基：GB 4789. 35—2010《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》［6］

1.1.3 人工胃液［7］: NaCl( 125 mmol/L) 、KCl( 7 mmol/L) 、NaHCO3( 45 mmol/L) 和胃蛋白酶( 3 g/L) ，用HCl 將溶液 pH 調至 3. 0，用 0. 20μm 的微孔濾膜過濾除菌。

1.1.4 人工腸液［8］: 胰蛋白酶( 1g/L) 、豬膽鹽( 3 g/L)，用NaOH調pH至7. 5，過濾除菌。

1.2實驗方法

1.2.1 乳酸菌耐酸實驗

用HCl 將液體MRS培養基 pH調至3.0，115℃滅菌30 min待用。將菌株於37℃ 條件下活化24 h，取3mL菌液進行離心( 4500 r/min，10min)，離心所得菌體用無菌生理鹽水洗滌，使用上述100 mL MRS 液體培養基對菌體進行重懸，pH6. 8的MRS液體培養基作為對照，37℃ 培養，使用菌落平板計數法分別於 0、4 h 進行活菌計數，計算存活率。

1.2.2 膽鹽耐受性實驗

使用NaOH將MRS液體培養基的pH調至8. 0，在其中加入豬膽鹽，使膽鹽終質量濃度為3 g/L，121℃滅菌20 min待用。按照1. 2. 1中的方法接入上述準備好的培養基中，以不添加膽鹽的培養基作為對照，37℃培養，使用菌落平板計數法分別於 0、6 h 進行活菌計數，計算存活率。

1.2.3 乳酸菌對腸胃液的耐受性測定

人工動物胃腸液耐受性實驗按照 1. 2. 1中的方法獲得菌體，將菌體用等體積配製好的人工動物胃液重懸，在搖床上培養模擬胃液的消化作用［9］( 37℃ 80 r/min) ，4h後，將人工胃液離心( 4500 r/min，10 min)，收集菌體，菌體用等體積的人工動物腸液重懸，按照上述條件培養，6h後取樣計算活菌數。

1.2.4 抑菌實驗

1.2.4.1 發酵濾液的製備

取24h 培養液8mL 離心10min 後，除去菌體取上清液，收集濾液即為發酵濾液。

1.2.4.2 乳酸菌菌體懸液的製備

將離心後的菌體沉澱用PBS 緩衝液（pH 為7.0）洗滌3 次，然後再用生理鹽水稀釋成原菌液濃度。

1.2.4.3 發酵液、發酵濾液與菌體懸液抑菌試驗

將活化好的病原菌梯度稀釋至107數量級，將病原菌塗佈於LB平板上，在平板上等距放4個牛津杯，吸取200uL各乳酸菌發酵液、發酵濾液、乳酸菌菌體懸液於杯中，每株菌做3個重複，平放於4℃冰箱過夜，次日置於30℃恆溫培養箱培養24h，測其抑菌圈直徑。

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結果與討論

2.1 耐酸耐膽鹽實驗

在到達腸道末端發揮益生功能之前，乳酸菌必須通過胃液的酸性環境，斷奶仔豬的胃液 pH 值在3. 1 -4. 0 範圍內變化［10］，胃完全排空時間為 3 ～ 5h［11]，由實驗結果可知實驗所用7株菌，LB-1，LB-3，LB-6在pH3.0條件下培養後，與對照組相比，存活率均高達90%以上，對低pH環境耐受能力較強，能夠通過胃酸環境到達腸道，進而發揮作用。

乳酸菌在通過胃液到達十二指腸後，必須能夠耐受十二指腸中高濃度的膽鹽，以活菌的狀態到達下消化道［12］，仔豬腸道中的膽鹽濃度在0. 03% ～0. 3%變化［13］。膽鹽耐受實驗中，LB-1，LB-4，LB-6對膽鹽鹽耐受能力也高於其他實驗菌株，3g/L膽鹽處理後，菌量仍能達到106cfu/ml，因此，選取LB-1，LB-4，LB-6接下來實驗的實驗菌株。

2.2 腸胃液耐受性實驗

由圖3-圖5可知，實驗所用乳酸菌在人工胃液作用4h後，數量稍有增加，在接入腸液後，數量開始下降，說明腸液中高濃度胰蛋白酶及膽鹽共同作用下，菌種活力下降，但其數量仍能達到108cfu/ml，能夠滿足益生菌發揮益生性能所需菌量，說明LB-1，LB-4，LB-6三株菌均具有較好的抗逆能力，能夠通過腸胃道，並發揮益生作用。

2.3抑菌實驗

乳酸菌對致病菌的抑制能力大小可以通過抑菌圈直徑來判斷，由表2.1可知，三株乳酸菌發酵液及發酵濾液對大腸桿菌及沙門氏菌均有不同能力的抑制能力，抑制強弱視菌種差異不同，但菌體並不具備抑菌能力，由此可知，本實驗所用乳酸菌抑菌能力來源於其代謝產物。

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結論

乳酸菌是飼用微生態製劑常用菌種，本研究以實驗室保藏菌株為實驗菌株，通低pH，與高膽鹽濃度培養基篩選，得到三株具有較強耐酸耐膽鹽能力菌株，經人工腸胃液作用10h後，數量仍能達到108,能夠滿足益生菌發揮益生性能最低菌量，因此，本實驗中得到的三株菌具有應用於飼用微生態製劑的潛力。

參考文獻

[1] 鄭愛武, 梁秀榮. 飼料污染對綠色畜產品生產的影響及控制措施[J]. 河南畜牧獸醫:市場版, 2008(5): 19-21

[2] Cheng G Y, Hao H H, Xie S Y, et al. Antibiotic alternatives: the substitution

[3] 張瑞霜, 單安山. 淺析我國飼料安全問題及對策[J]. 飼料博覽, 2009 (6): 14-16

[4] Kimura K, McCartney A L, McConnell M A, et al.Analysis of fecal populations of bifidobacteria and lactobacilli and investigation of the immunological responses of their human hosts to the predominant

[5] 楊麗傑, 王俊滬. 乳酸乳球菌中雙乙醯代謝支路的調控. 中國乳品工業, 2004, 5(32): 24-29.

[6] GB 4789．35—2010食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗［S］

[7] Deangelis M，Siragusa S，Berloco M，et al．Selection of potential probiotic lactobacilli from pig fecesto be used as additives in pelleted feeding［J］. Researchin Microbiology，2006，157( 8) : 792 － 801．

[8] Guo Xiao-Hua, Li De-Fa, Lu Wen-Qing, et al. Screening of Bacillus strains as potential probiotics and subsequentconfirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilisMA139 in pigs[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2006, 90( 2) : 139 －146．

[9] Fushsr L, Reamje, Hammond B G, et al. Safety assessment of the neomycin phosphotransferase II ( NPTII)protein［J］．Bio Technology，1993，11 ( 13 ) : 1 543 －1 547．

[10] 周其家，朱翔宇． 仔豬消化環境與營養代謝調節劑的應用［J］．畜牧獸醫科技信息，2011 ( 5) : 56－57．

[11] Duaryr K, Batish V K, Grover S. Expression of the atpD gene in probiotic Lactobacillus plantarum strains under in vitro acidic conditions using ＲT-qPCＲ［J］． Ｒesearch in Microbiology，2010，161( 5) : 399 － 405．

[12] 胡斌． 植物乳桿菌膽鹽耐受性評價及內在影響因素[D]. 無錫: 江南大學，2015: 3 －5．

[13] 李琳琳，王雅婷，楊欣，等. 豬源乳酸菌的分離及其生物學特性研究［J］. 西北農林科技大學學報，2016，44( 2) : 1 －7．

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